Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Genfektors foar de behanneling fan pulmonale cystyske fibrosis moatte rjochte wurde op de conductive luchtwegen, om't perifeare longtransduksje gjin therapeutysk effekt hat.De effisjinsje fan virale transduksje is direkt relatearre oan de ferbliuwstiid fan 'e drager.Leveringsfloeistoffen lykas gendragers diffúsje lykwols natuerlik yn 'e alveoli by ynhalaasje, en therapeutyske dieltsjes fan elke foarm wurde rap fuortsmiten troch mucociliary transport.It ferlingjen fan de ferbliuwstiid fan gendragers yn 'e luchtwegen is wichtich, mar dreech te berikken.Carrier-konjugearre magnetyske dieltsjes dy't kinne wurde rjochte op it oerflak fan 'e luchtwegen kinne regionale doelen ferbetterje.Troch problemen mei in vivo-ôfbylding wurdt it gedrach fan sokke lytse magnetyske dieltsjes op it oerflak fan 'e luchtwei yn' e oanwêzigens fan in tapast magnetysk fjild min begrepen.It doel fan dizze stúdzje wie om synchrotron-ôfbylding te brûken om in vivo de beweging fan in searje magnetyske dieltsjes yn 'e trachea fan anesthetisearre rotten te visualisearjen om de dynamyk en gedrachspatroanen fan inkele en bulkdieltsjes yn vivo te studearjen.Wy hawwe doe ek beoardiele oft levering fan lentivirale magnetyske dieltsjes yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild de effisjinsje fan transduksje yn' e rat trachea soe ferheegje.Synchrotron X-ray imaging toant it gedrach fan magnetyske dieltsjes yn stasjonêre en bewegende magnetyske fjilden in vitro en in vivo.Mei help fan magneten kinne dieltsjes net maklik oer it oerflak fan libbene luchtwegen sleept wurde, mar by it ferfier wurde ôfsettings konsintrearre yn it sichtfjild, dêr't it magnetysk fjild it sterkst is.Transduksje-effisjinsje waard ek seis kear ferhege doe't lentivirale magnetyske dieltsjes waarden levere yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild.Mei-inoar suggerearje dizze resultaten dat lentivirale magnetyske dieltsjes en magnetyske fjilden weardefolle oanpakken kinne wêze om genevektor-targeting en transduksjenivo's yn 'e conductive airways in vivo te ferbetterjen.
Cystyske fibrosis (CF) wurdt feroarsake troch fariaasjes yn ien gen neamd de CF transmembrane conductance regulator (CFTR).It CFTR-protein is in ionkanaal dat oanwêzich is yn in protte epitheliale sellen yn it heule lichem, ynklusyf de luchtwegen, in wichtige side yn 'e patogenesis fan cystyske fibrosis.Defekten yn CFTR liede ta abnormaal wetterferfier, útdroeging fan 'e luchtwei-oerflak, en fermindere luchtwei-oerflakfluidlaach (ASL) djipte.It beynfloedet ek it fermogen fan it mucociliary transport (MCT) systeem om de luchtwegen te wiskjen fan ynademe dieltsjes en patogenen.Us doel is om in lentivirale (LV) gen-terapy te ûntwikkeljen om de juste kopy fan it CFTR-gen te leverjen en ASL-, MCT- en longsûnens te ferbetterjen, en trochgean mei it ûntwikkeljen fan nije technologyen dy't dizze parameters yn vivo1 kinne mjitte.
LV-fektors binne ien fan 'e liedende kandidaten foar gen-terapy foar cystyske fibrosis, benammen om't se it terapeutyske gen permanint kinne yntegrearje yn basale sellen fan' e luchtwei (stamsellen fan 'e luchtwei).Dit is wichtich om't se normale hydratisaasje en slymferwidering kinne weromsette troch te ûnderskieden yn funksjonele gene-korrizjearre luchtwei-oerflakzellen ferbûn mei cystyske fibrose, wat resulteart yn libbenslange foardielen.LV-fektors moatte rjochte wurde tsjin de liedende luchtwegen, om't dit is wêr't de belutsenens fan 'e longen by CF begjint.Levering fan 'e fektor djipper yn' e long kin resultearje yn alveolêre transduksje, mar dit hat gjin therapeutysk effekt yn cystyske fibrosis.Fluids lykas gendragers migrearje lykwols natuerlik yn 'e alveoli as se ynhale wurde nei de berte3,4 en therapeutyske dieltsjes wurde rap yn' e mûnlinge holte ferdreaun troch MCT's.De effisjinsje fan LV-transduksje is direkt relatearre oan 'e lingte fan' e tiid dat de fektor tichtby de doelsellen bliuwt om sellulêre opname te meitsjen - "ferbliuwstiid" 5 dy't maklik ynkoarte wurdt troch typyske regionale luchtstream as koördinearre opname fan slym en MCT-dieltsjes.Foar cystyske fibrosis is de mooglikheid om LV-ferbliuwstiid yn 'e luchtwegen te ferlingjen wichtich om hege nivo's fan transduksje yn dit gebiet te berikken, mar hat oant no ta útdaagjend west.
Om dizze hindernis te oerwinnen, stelle wy foar dat LV magnetyske dieltsjes (MP's) kinne helpe op twa komplementêre manieren.Earst kinne se wurde liede troch in magneet nei it oerflak fan 'e luchtwei om it doel te ferbetterjen en dieltsjes fan gendrager te helpen yn it juste gebiet fan' e luchtwei te wêzen;en ASL) ferpleatse yn sel laach 6. MP's wurde in soad brûkt as doelbewuste drug delivery vehicles as se bine oan antistoffen, gemoterapy drugs, of oare lytse molekulen dy't hechtsje oan sel membranen of bine oan harren respektive sel oerflak receptors en accumulearje op tumor sites yn oanwêzigens fan statyske elektrisiteit.Magnetyske fjilden foar kankerterapy 7. Oare "hyperthermyske" metoaden binne rjochte op it fermoardzjen fan tumorsellen troch ferwaarming fan MP's by bleatstelling oan oscillerende magnetyske fjilden.It prinsipe fan magnetyske transfeksje, wêrby't in magnetysk fjild wurdt brûkt as transfeksje-agint om de oerdracht fan DNA yn sellen te ferbetterjen, wurdt faak brûkt in vitro mei in ferskaat oan net-virale en virale genvektors foar dreech te transduce sellinen ..De effisjinsje fan LV-magnetotransfeksje mei de levering fan LV MP in vitro yn in selleline fan minsklik bronchiale epithelium yn 'e oanwêzigens fan in statysk magnetysk fjild waard fêststeld, wat de effisjinsje fan transduksje mei 186 kear fergrutte yn fergeliking mei de LV-fektor allinich.LV MT is ek tapast op in in vitro-model fan cystyske fibrose, wêrby't magnetyske transfeksje LV-transduksje yn loft-flüssige ynterfacekultueren mei in faktor fan 20 yn 'e oanwêzigens fan cystyske fibrosis sputum10 ferhege.In vivo orgaanmagnetotransfeksje hat lykwols relatyf lyts omtinken krigen en is allinich evaluearre yn in pear bistestúdzjes11,12,13,14,15, benammen yn 'e longen16,17.De mooglikheden fan magnetyske transfeksje yn longterapy by cystyske fibrose binne lykwols dúdlik.Tan et al.(2020) stelde dat "in validaasjestúdzje oer effektive pulmonêre levering fan magnetyske nanopartikels it paad sil baan foar takomstige CFTR-ynhalaasjestrategyen om klinyske resultaten te ferbetterjen yn pasjinten mei cystyske fibrose"6.
It gedrach fan lytse magnetyske dieltsjes op it oerflak fan 'e luchtwegen yn' e oanwêzigens fan in tapast magnetysk fjild is dreech te visualisearjen en te studearjen, en dêrom wurde se min begrepen.Yn oare stúdzjes hawwe wy in Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) metoade ûntwikkele foar net-invasive imaging en kwantifikaasje fan minute in vivo feroarings yn ASL18 djipte en MCT19 gedrach,20 om direkt gaskanaal oerflakhydrataasje te mjitten en wurdt brûkt as in betide yndikator behanneling effektiviteit.Derneist brûkt ús MCT-skoaremetoade dieltsjes mei in diameter fan 10–35 µm gearstald út aluminiumoxide as glês mei hege brekingsyndeks as MCT-markers sichtber mei PB-PCXI21.Beide metoaden binne geskikt foar it ôfbyldzjen fan in ferskaat oan partikeltypen, ynklusyf MP's.
Troch de hege romtlike en tydlike resolúsje binne ús PB-PCXI-basearre ASL- en MCT-assays goed geskikt om de dynamyk en gedrachspatroanen fan single- en bulkdieltsjes in vivo te studearjen om ús te helpen te begripen en te optimalisearjen fan MP-genleveringsmetoaden.De oanpak dy't wy hjir brûke is basearre op ús stúdzjes mei de SPring-8 BL20B2 beamline, wêryn't wy floeibere beweging visualisearre nei levering fan in doasis fan in dummy-fektor yn 'e nasale en pulmonêre luchtwegen fan mûzen om te helpen te ferklearjen fan ús waarnommen heterogene gen-ekspresjepatroanen yn ús gen.dierstúdzjes mei in dragerdosis fan 3,4.
It doel fan dizze stúdzje wie it PB-PCXI synchrotron te brûken om in vivo-bewegingen fan in searje MP's yn 'e trachea fan libbene rotten te visualisearjen.Dizze PB-PCXI-ôfbyldingstúdzjes binne ûntworpen om de MP-searje, magnetyske fjildsterkte en lokaasje te testen om har effekt op MP-beweging te bepalen.Wy oannommen dat in ekstern magnetysk fjild soe helpe de levere MF bliuwe of ferpleatse nei it doelgebiet.Dizze stúdzjes hawwe ús ek tastien om magneetkonfiguraasjes te bepalen dy't de hoemannichte dieltsjes maksimalisearje yn 'e trachea nei ôfsetting.Yn in twadde searje stúdzjes wiene wy ​​fan doel om dizze optimale konfiguraasje te brûken om it transduksjepatroan te demonstrearjen dat resulteart út in vivo levering fan LV-MP's oan 'e rat-luchtwegen, op 'e oanname dat levering fan LV-MP's yn 'e kontekst fan luchtwei-targeting soe resultearje yn ferhege LV transduction effisjinsje..
Alle bistestúdzjes waarden útfierd yn oerienstimming mei protokollen goedkard troch de Universiteit fan Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.De eksperiminten waarden útfierd yn oerienstimming mei de oanbefellings fan ARRIVE.
Alle x-ray-ôfbyldings waarden nommen by de BL20XU-beamline by de SPring-8-synchrotron yn Japan mei in opset fergelykber mei dy earder beskreaun21,22.Koartsein, de eksperimintele doaze siet 245 m fan 'e synchrotron-opslachring.In sample-to-detektor-ôfstân fan 0,6 m wurdt brûkt foar partikel-ôfbyldingstúdzjes en 0,3 m foar in vivo-ôfbyldingstúdzjes om fazekontrasteffekten te meitsjen.In monochromatyske beam mei in enerzjy fan 25 keV waard brûkt.De ôfbyldings waarden krigen mei in hege resolúsje röntgentransducer (SPring-8 BM3) keppele oan in sCMOS-detektor.De transducer konvertearret röntgenstralen nei sichtber ljocht mei in 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), dy't dan rjochte wurdt nei de sCMOS-sensor mei in ×10 (NA 0.3) mikroskoopobjektyf.De sCMOS-detektor wie in Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mei in arraygrutte fan 2048 × 2048 piksels en in rau pikselgrutte fan 6.5 × 6.5 µm.Dizze ynstelling jout in effektive isotropyske pikselgrutte fan 0,51 µm en in sichtfjild fan likernôch 1,1 mm × 1,1 mm.De eksposysjeduur fan 100 ms waard keazen om de sinjaal-oan-lûd-ferhâlding fan magnetyske dieltsjes binnen en bûten de luchtwegen te maksimalisearjen, wylst bewegingsartefakten wurde feroarsake troch sykheljen.Foar in vivo-stúdzjes waard in snelle röntgen-shutter yn it röntgenpaad pleatst om de stralingsdosis te beheinen troch de röntgenstraal tusken eksposysje te blokkearjen.
LV media waard net brûkt yn alle SPring-8 PB-PCXI imaging stúdzjes omdat de BL20XU imaging keamer is net Biosafety Level 2 sertifisearre.Ynstee hawwe wy in berik fan goed karakterisearre parlemintsleden selektearre fan twa kommersjele leveransiers dy't in ferskaat oan maten, materialen, izerkonsintraasjes en tapassingen dekke, - earst om te begripen hoe't magnetyske fjilden ynfloed hawwe op de beweging fan parlemintsleden yn glêzen kapillaren, en dan yn libbene luchtwegen.oerflak.De grutte fan 'e MP fariearret fan 0,25 oant 18 µm en is makke fan ferskate materialen (sjoch Tabel 1), mar de gearstalling fan elke stekproef, ynklusyf de grutte fan' e magnetyske dieltsjes yn 'e MP, is ûnbekend.Op grûn fan ús wiidweidige MCT-stúdzjes 19, 20, 21, 23, 24, ferwachtsje wy dat MP's oant 5 µm kinne wurde sjoen op it oerflak fan 'e tracheale luchtwei, bygelyks troch opfolgjende frames te subtrahearjen om ferbettere sichtberens fan MP-beweging te sjen.In inkele MP fan 0.25 µm is lytser as de resolúsje fan it ôfbyldingsapparaat, mar PB-PCXI wurdt ferwachte dat se har volumetryske kontrast en de beweging fan 'e oerflakflüssigens opspoare wêrop se wurde dellein nei't se dellein binne.
Samples foar elke MP yn 'e tabel.1 waard taret yn 20 μl glêzen kapillaren (Drummond Microcaps, PA, USA) mei in ynterne diameter fan 0,63 mm.Corpuskulêre dieltsjes binne te krijen yn wetter, wylst CombiMag-dieltsjes te krijen binne yn 'e proprietêre floeistof fan' e fabrikant.Elke buis is heal fol mei flüssigens (likernôch 11 µl) en pleatst op 'e stekproefhâlder (sjoch figuer 1).De glêzen kapillaren waarden respektivelik horizontaal op it poadium yn 'e ôfbyldingskeamer pleatst en oan' e rânen fan 'e flüssigens pleatst.In 19 mm diameter (28 mm lang) nikkel-shell magneet makke fan seldsume ierde, neodymium, izer en boron (NdFeB) (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Austraalje) mei in remaninsje fan 1,17 T waard fêstmakke op in aparte oerdracht tafel te berikken Feroarje jo posysje op ôfstân ûnder rendering.Röntgenôfbylding begjint as de magneet sawat 30 mm boppe it stekproef wurdt pleatst en ôfbyldings wurde krigen mei 4 frames per sekonde.Tidens de ôfbylding waard de magneet tichtby de glêzen kapillêre buis brocht (op in ôfstân fan sa'n 1 mm) en ferpleatst dan lâns de buis om it effekt fan fjildsterkte en posysje te beoardieljen.
In yn vitro imaging opset mei MP-monsters yn glêzen kapillaren op it poadium fan oersetting fan it xy-monster.It paad fan 'e X-ray beam is markearre mei in reade stippelline.
Sadree't de in vitro sichtberens fan parlemintsleden waard fêststeld, waard in subset fan har test yn vivo op wylde-type froulike Wistar albino ratten (~ 12 wiken âld, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ratten waarden anesthetized mei Pharma (Japan) mingsel troch intraperitoneale ynjeksje.Nei anaesthesia waarden se taret op ôfbylding troch it fuortheljen fan 'e bont om' e trachea, it ynfoegjen fan in endotracheale buis (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), en immobilisearje se yn 'e supine posysje op in oanpaste ôfbyldingsplaat mei in termyske tas te behâlden lichemstemperatuer.22. De ôfbyldingsplaat waard doe oan 'e sample-poadium yn' e ôfbyldingsfak yn in lichte hoeke hechte om de trachea horizontaal op 'e röntgenôfbylding te rjochtsjen lykas werjûn yn figuer 2a.
(a) In vivo imaging opset yn de SPring-8 imaging ienheid, X-ray beam paad markearre mei reade stippelline.(b, c) Tracheal magneet lokalisaasje waard op ôfstân útfierd mei twa ortogonaal monteare IP-kamera's.Oan 'e linkerkant fan' e ôfbylding op it skerm kinne jo de draadlus sjen dy't de holle hâldt en de leveringskanule ynstalleare yn 'e ET-buis.
In op ôfstân regele syringe pomp systeem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mei help fan in 100 µl glêzen spuit waard ferbûn oan in PE10 tubing (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) mei help fan in 30 Ga needle.Markearje de buis om te soargjen dat de tip yn 'e juste posysje yn' e trachea is by it ynfoegjen fan 'e endotracheale buis.Mei help fan in mikropomp waard de spuitplunjer fuortsmiten en de tip fan 'e buis waard ûnderdompele yn it MP-monster om te leverjen.De laden leveringsbuis waard doe yn 'e endotracheale buis ynfoege, en pleatste de tip op it sterkste diel fan ús ferwachte tapaste magnetyske fjild.Ofbyldingswinning waard regele mei in azemdetektor ferbûn oan ús Arduino-basearre timingfak, en alle sinjalen (bgl. temperatuer, respiraasje, sluter iepen / slute, en ôfbyldingswinning) waarden opnommen mei Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Austraalje) 22 As Imaging Doe't de húsfesting net beskikber wie, waarden twa IP-kamera's (Panasonic BB-SC382) op sawat 90 ° nei elkoar pleatst en brûkt om de posysje fan 'e magneet relatyf oan' e trachea te kontrolearjen by ôfbylding (figuer 2b, c).Om bewegingsartefakten te minimalisearjen, waard ien ôfbylding per azem krigen tidens it terminale respiratory flow plateau.
De magneet is hechte oan 'e twadde etappe, dy't op ôfstân oan' e bûtenkant fan 'e ôfbyldingslichem lizze kin.Ferskate posysjes en konfiguraasjes fan 'e magneet waarden hifke, ynklusyf: pleatst yn in hoeke fan likernôch 30 ° boppe de trachea (konfiguraasjes wurde werjûn yn figueren 2a en 3a);ien magneet boppe it bist en de oare ûnder, mei de peallen set foar attraksje (figuer 3b)., ien magneet boppe it bist en ien ûnder, mei de peallen ynsteld foar ôfwiking (figuer 3c), en ien magneet boppe en loodrecht op 'e trachea (figuer 3d).Nei it ynstellen fan it bist en de magneet en it laden fan de MP ûnder test yn 'e spuitpomp, leverje in doasis fan 50 µl mei in snelheid fan 4 µl / sek by oankeap fan ôfbyldings.De magneet wurdt dan hinne en wer lâns of oer de luchtpijp ferpleatst, wylst trochgean mei it krijen fan bylden.
Magneetkonfiguraasje foar in vivo-ôfbylding (a) ien magneet boppe de luchtpijp yn in hoeke fan likernôch 30°, (b) twa magneten konfigurearre foar attraksje, (c) twa magneten konfigureare foar ôfwiking, (d) ien magneet boppe en loodrecht op de trachea.De waarnimmer seach fan 'e mûle nei de longen troch de luchtpijp en de röntgenstraal gie troch de lofterkant fan 'e rôt en kaam de rjochterkant út.De magneet wurdt ofwol oer de lingte fan 'e luchtwei ferpleatst of lofts en rjochts boppe de trachea yn' e rjochting fan 'e röntgenstraal.
Wy sochten ek de sichtberens en gedrach fan dieltsjes yn 'e luchtwegen te bepalen yn' e ôfwêzigens fan ming fan respiraasje en hertslach.Dêrom, oan 'e ein fan' e imaging perioade, bisten waarden minsklik euthanized fanwege pentobarbital overdose (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip).Guon bisten waarden oerbleaun op it byldplatfoarm, en nei it stopjen fan sykheljen en hertslach, waard it byldproses werhelle, en in ekstra dosis MP tafoege as gjin MP sichtber wie op it oerflak fan 'e luchtwei.
De resultearjende ôfbyldings waarden korrizjearre foar flak en tsjuster fjild en dêrnei gearstald yn in film (20 frames per sekonde; 15-25 × normale snelheid ôfhinklik fan respiraasjesnelheid) mei in oanpast skript skreaun yn MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle stúdzjes oer levering fan LV-genvektor waarden útfierd oan it University of Adelaide Laboratory Animal Research Center en wiene fan doel de resultaten fan it SPring-8-eksperimint te brûken om te beoardieljen oft LV-MP-levering yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild de gentransfer yn vivo koe ferbetterje .Om de effekten fan MF en magnetysk fjild te evaluearjen, waarden twa groepen bisten behannele: ien groep waard ynjeksje mei LV MF mei magneet pleatsing, en de oare groep waard ynjeksje mei in kontrôtgroep mei LV MF sûnder magneet.
LV-genfektors binne generearre mei earder beskreaune metoaden 25, 26.De LacZ-fektor drukt in nukleêre lokalisearre beta-galactosidase-gen út, dreaun troch de MPSV-konstitutive promotor (LV-LacZ), dy't in blau reaksjeprodukt produsearret yn transducearre sellen, sichtber op fronten en seksjes fan longweefsel.Titraasje waard útfierd yn selkultueren troch it oantal LacZ-positive sellen manuell te tellen mei in hemocytometer om de titer yn TU / ml te berekkenjen.Dragers wurde cryopreserved by -80 ° C, ûntdutsen foar gebrûk, en bûn oan CombiMag troch it mingen 1: 1 en ynkubearje op iis foar op syn minst 30 minuten foarôfgeand oan levering.
Normale Sprague Dawley-ratten (n = 3 / groep, ~ 2-3 anesthetized ip mei in mingsel fan 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Austraalje) en 60mg / kg ketamine (Ilium, Austraalje) op 1 moanne âldens) ip ) ynjeksje en net-sjirurgyske mûnlinge kanule mei in 16 Ga intravenous cannula.Om derfoar te soargjen dat tracheale luchtwei weefsel LV transduction ûntfangt, waard it kondisearre mei ús earder beskreaune meganyske fersteuringsprotokol wêryn it oerflak fan 'e tracheale luchtwei axiaal waard wrijven mei in draadkorf (N-Circle, nitinolstien extractor sûnder tip NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, Feriene Steaten) 30 p28.Dan, sawat 10 minuten nei de fersteuring yn 'e biofeiligenskabinet, waard tracheale administraasje fan LV-MP útfierd.
It magnetyske fjild brûkt yn dit eksperimint waard konfigurearre lykas in in vivo x-ray stúdzje, mei deselde magneten holden oer de trachea mei destillaasje stent clamps (figuer 4).In 50 µl folume (2 x 25 µl aliquots) fan LV-MP waard levere oan 'e trachea (n = 3 bisten) mei in gel-tipped pipette lykas earder beskreaun.De kontrôtgroep (n = 3 bisten) krige deselde LV-MP sûnder it brûken fan in magneet.Nei it foltôgjen fan 'e infuzje wurdt de kanyle út' e endotracheale buis fuortsmiten en it bist wurdt extubearre.De magneet bliuwt 10 minuten op syn plak foardat se fuortsmiten wurde.Ratten waarden subkutan dosearre mei meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Austraalje) folge troch anaesthesia weromlûking troch intraperitoneale ynjeksje fan 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Austraalje).Ratten waarden waarm hâlden en waarnommen oant folslein herstel fan anaesthesia.
LV-MP levering apparaat yn in biologyske feiligens kabinet.Jo kinne sjen dat de ljochtgrize Luer-lock-sleeve fan 'e ET-buis út' e mûle stekt, en de gelpipette tip werjûn yn 'e figuer wurdt ynfoege troch de ET-buis nei de winske djipte yn' e trachea.
Ien wike nei de LV-MP-administraasjeproseduere waarden bisten minsklik opoffere troch ynhalaasje fan 100% CO2 en LacZ-ekspresje waard beoardiele mei ús standert X-gal-behanneling.De trije meast caudale kraakbeenringen waarden fuortsmiten om te soargjen dat alle meganyske skea of ​​floeistofbehâld troch pleatsing fan endotracheale buis net yn 'e analyze opnommen wurde soe.Elke trachea waard yn 'e lingte knipt om twa helten te krijen foar analyse en pleatst yn in beker mei silikongummi (Sylgard, Dow Inc) mei in Minutien-naald (Fine Science Tools) om it luminale oerflak te visualisearjen.De ferdieling en karakter fan de transduced sellen waarden befêstige troch frontale fotografy mei help fan in Nikon mikroskoop (SMZ1500) mei in DigiLite kamera en TCapture software (Tucsen Photonics, Sina).Ofbyldings waarden oanskaft by 20x fergrutting (ynklusyf de maksimale ynstelling foar de folsleine breedte fan 'e trachea), mei de heule lingte fan' e trachea stap foar stap werjûn, en soarget foar genôch oerlap tusken elke ôfbylding om ôfbyldings te "stikjen".De bylden fan elke trachea waarden doe kombinearre yn ien gearstalde ôfbylding mei Composite Image Editor ferzje 2.0.3 (Microsoft Research) mei it planêre bewegingsalgoritme. It gebiet fan LacZ-ekspresje binnen de tracheale gearstalde ôfbyldings fan elk bist waard kwantifisearre mei in automatisearre MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) lykas earder beskreaun28, mei ynstellingen fan 0.35 <Tint <0.58, Saturation> 0.15, en wearde <0.7. It gebiet fan LacZ-ekspresje binnen de tracheale gearstalde ôfbyldings fan elk bist waard kwantifisearre mei in automatisearre MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) lykas earder beskreaun28, mei ynstellingen fan 0.35 <Tint <0.58, Saturation> 0.15, en wearde <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. It gebiet fan LacZ-ekspresje yn gearstalde tracheale bylden fan elk bist waard kwantifisearre mei in automatisearre MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) lykas earder beskreaun28 mei ynstellingen fan 0.350,15 en wearde<0,7.如 前所 述, 使用 自动 Matlab 脚本 (R2020a, MathWorks) 对 来自 每 只 动物 的 的 复合 图像 表达 区域 进行 量化, ​​使用 0,35 <色调 <0.58, 饱和度> 0,15 和值 <0.7 的.如 前所 述, 自动 Matlab 脚本 ((R2020a, MathWorks) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 0,35 <色调 <0.58,> 0,15 和值 <0.7 的 ..... 。。。。。。。。。。。。。。。。… HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Gebieten fan LacZ-ekspresje op gearstalde ôfbyldings fan 'e trachea fan elk bist waarden kwantifisearre mei in automatisearre MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) lykas earder beskreaun mei ynstellingen fan 0.35 < kleur <0.58, sêding> 0.15 en wearde <0.7.Troch weefselkonturen te folgjen yn GIMP v2.10.24, waard in masker manuell makke foar elke gearstalde ôfbylding om it weefselgebiet te identifisearjen en falske deteksjes bûten it tracheale weefsel te foarkommen.De bûnte gebieten fan alle gearstalde bylden fan elk bist waarden gearfette om it totale bûnte gebiet foar dat bist te jaan.It skildere gebiet waard dan dield troch it totale gebiet fan it masker om in normalisearre gebiet te krijen.
Elke trachea waard ynbêde yn paraffine en yndield yn 5 µm dik.Seksjes waarden counterstained mei neutraal fluch read foar 5 minuten en bylden waarden oankocht mei in Nikon Eclipse E400 mikroskoop, DS-Fi3 kamera en NIS elemint capture software (ferzje 5.20.00).
Alle statistyske analyzes waarden útfierd yn GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistyske betsjutting waard ynsteld op p ≤ 0,05.Normaliteit waard hifke mei de Shapiro-Wilk-test en ferskillen yn LacZ-kleuring waarden beoardiele mei in unpaired t-test.
De seis MP's beskreaun yn Tabel 1 waarden ûndersocht troch PCXI, en de sichtberens wurdt beskreaun yn Tabel 2. Twa polystyrene MP's (MP1 en MP2; respektivelik 18 µm en 0,25 µm) wiene net sichtber troch PCXI, mar de oerbleaune samples koenen wurde identifisearre (foarbylden wurde werjûn yn figuer 5).MP3 en MP4 binne swak sichtber (10-15% Fe3O4; respektivelik 0,25 µm en 0,9 µm).Hoewol MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) guon fan 'e lytste ûndersochte dieltsjes befette, wie it it meast útsprutsen.It CombiMag MP6-produkt is dreech te ûnderskieden.Yn alle gefallen waard ús fermogen om MF's te detektearjen sterk ferbettere troch de magneet hinne en wer parallel oan 'e kapillair te bewegen.Doe't de magneten fuort fan 'e kapillair ferhuze, waarden de dieltsjes yn lange keatlingen útlutsen, mar doe't de magneten oankamen en de magnetyske fjildsterkte tanommen, waarden de dieltsjeskeatlingen ynkoarte doe't de dieltsjes nei it boppeste oerflak fan 'e kapillair migrearren (sjoch Supplemental Video S1 : MP4), it fergrutsjen fan de dieltsjetichtens oan it oerflak.Oarsom, doe't de magneet wurdt fuorthelle út de capillary, de fjild sterkte nimt ôf en de MPs rearrange yn lange keatlingen útwreidzjen fan it boppeste oerflak fan de capillary (sjoch Supplementary Video S2: MP4).Nei't de magneet ophâldt te bewegen, bliuwe de dieltsjes in skoft nei it berikken fan 'e lykwichtsposysje.As de MP nei en fuort beweecht fan it boppeste oerflak fan 'e kapillair, hawwe de magnetyske dieltsjes de neiging om pún troch de floeistof te lûken.
De sichtberens fan MP ûnder PCXI fariearret gâns tusken samples.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.Alle ôfbyldings werjûn hjir waarden nommen mei in magneet pleatst likernôch 10 mm direkt boppe de capillary.De skynbere grutte sirkels binne luchtbellen fongen yn 'e kapillaren, dúdlik sjen litte de swarte en wite râne eigenskippen fan de faze kontrast ôfbylding.It reade fak jout de fergrutting oan dy't it kontrast fersterket.Tink derom dat de diameters fan de magneet circuits yn alle sifers binne net op skaal en binne likernôch 100 kear grutter as werjûn.
As de magneet lofts en rjochts lâns de top fan 'e kapillair beweecht, feroaret de hoeke fan' e MP-string om te rjochtsjen op 'e magneet (sjoch figuer 6), sadat de linen fan it magnetyske fjild ôfstimme.Foar MP3-5, neidat it akkoard berikt de drompel hoeke, de dieltsjes slepe lâns de boppeste oerflak fan de capillary.Dit resultearret faak yn MP's klusterje yn gruttere groepen tichtby wêr't it magnetysk fjild it sterkst is (sjoch Oanfoljende fideo S3: MP5).Dit is ek foaral evident by it ôfbyldzjen fan tichtby it ein fan 'e kapillair, wat feroarsaket dat de MP aggregearret en konsintrearret op' e floeistof-loft-ynterface.De dieltsjes yn 'e MP6, dy't dreger te ûnderskieden wiene as dy yn' e MP3-5, sleepten net doe't de magneet lâns de kapillair beweech, mar de MP-stringen dissosjearre, wêrtroch't de dieltsjes yn 't sicht bleaune (sjoch Oanfoljende fideo S4: MP6).Yn guon gefallen, doe't it tapaste magnetyske fjild waard fermindere troch it ferpleatsen fan de magneet in lange ôfstân fan 'e ôfbyldingsside, sakke alle oerbleaune MP's stadichoan del nei it ûnderste oerflak fan' e buis troch swiertekrêft, bliuwend yn 'e snaar (sjoch Supplementary Video S5: MP3) .
De hoeke fan 'e MP-string feroaret as de magneet nei rjochts boppe de kapillair beweecht.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6.It reade fak jout de fergrutting oan dy't it kontrast fersterket.Tink derom dat de ekstra fideo's binne foar ynformative doelen, om't se wichtige partikelstruktuer en dynamyske ynformaasje iepenbierje dy't net kinne wurde visualisearre yn dizze statyske ôfbyldings.
Us tests hawwe oantoand dat it ferpleatsen fan de magneet stadichoan lâns de trachea de fisualisaasje fan 'e MF fasilitearret yn' e kontekst fan komplekse beweging yn vivo.Gjin in vivo tests waarden útfierd omdat de polystyrene kralen (MP1 en MP2) wiene net sichtber yn de capillary.Elk fan 'e oerbleaune fjouwer MF's waard yn vivo testen mei de lange as fan' e magneet pleatst oer de trachea yn in hoeke fan sawat 30 ° nei de fertikale (sjoch figueren 2b en 3a), om't dit resultearre yn langere MF-keatlingen en wie effektiver as in magneet..konfiguraasje beëinige.MP3, MP4 en MP6 binne net fûn yn 'e luchtpijp fan alle libbene bisten.By it visualisearjen fan it luchtwegen fan rotten nei it minsklik fermoardzjen fan 'e bisten, bleaune de dieltsjes ûnsichtber, sels as ekstra folume waard tafoege mei in spuitpomp.MP5 hie de heechste ynhâld fan izer okside en wie it ienige sichtbere dieltsje, dus it waard brûkt om MP-gedrach yn vivo te evaluearjen en te karakterisearjen.
Pleatsing fan 'e magneet oer de trachea tidens MF-ynfoegje resultearre yn in protte, mar net alle, MF's konsintrearre yn it sichtfjild.Tracheale yngong fan dieltsjes wurdt it bêste waarnommen yn minsklik euthanisearre bisten.Figure 7 en Supplementary Video S6: MP5 toant rappe magnetyske fangen en ôfstimming fan dieltsjes op it oerflak fan 'e ventral trachea, wat oanjout dat MP's kinne wurde rjochte op winske gebieten fan' e trachea.By it sykjen fan mear distaal lâns de trachea nei MF-levering, waarden guon MF's tichter by de carina fûn, wat oanjout op ûnfoldwaande magnetyske fjildsterkte om alle MF's te sammeljen en te hâlden, om't se waarden levere troch de regio fan maksimale magnetyske fjildsterkte tidens fluid administraasje.proses.Postnatale MP-konsintraasjes wiene lykwols heger om it byldgebiet, wat suggerearret dat in protte MP's yn luchtweiregio's bleaunen wêr't de tapaste magnetyske fjildsterkte it heechst wie.
Ofbyldings fan (a) foar en (b) nei levering fan MP5 yn 'e trachea fan in koartlyn euthanisearre rat mei in magneet pleatst krekt boppe it ôfbyldingsgebiet.It ôfbylde gebiet leit tusken twa cartilaginous ringen.Der is wat floeistof yn 'e luchtwegen foardat de MP wurdt levere.It reade fak jout de fergrutting oan dy't it kontrast fersterket.Dizze ôfbyldings binne nommen út 'e fideo te sjen yn S6: MP5 Supplementary Video.
It ferpleatsen fan de magneet lâns de trachea in vivo resultearre yn in feroaring yn 'e hoeke fan' e MP-ketting op 'e luchtwei oerflak, fergelykber mei dat waarnommen yn kapillaren (sjoch figuer 8 en Supplementary Video S7: MP5).Yn ús stúdzje koene parlemintsleden lykwols net oer it oerflak fan libbene luchtwegen sleept wurde, lykas kapillaren koenen dwaan.Yn guon gefallen wurdt de MP-ketting langer as de magneet nei links en rjochts beweecht.Ynteressant fûnen wy ek dat de partikelketen de djipte fan 'e oerflaklaach fan' e floeistof feroaret as de magneet yn 'e longitudinaal lâns de trachea wurdt ferpleatst, en útwreidet as de magneet direkt oer de kop ferpleatst wurdt en de partikelketen wurdt rotearre nei in fertikale posysje (sjoch Oanfoljende fideo S7).: MP5 om 0:09, rjochts ûnder).It karakteristike bewegingspatroan feroare doe't de magneet lateraal oer de top fan 'e trachea ferpleatst waard (dat wol sizze, nei lofts of rjochts fan it bist, ynstee fan oer de lingte fan' e trachea).De dieltsjes wiene noch dúdlik te sjen by har beweging, mar doe't de magneet út 'e luchtpijp helle waard, waarden de tips fan 'e dieltsjestringen sichtber (sjoch Oanfoljende fideo S8: MP5, begjinnend om 0:08).Dit komt oerien mei it waarnommen gedrach fan it magnetysk fjild ûnder de aksje fan in tapast magnetysk fjild yn in glêzen kapillair.
Foarbyldôfbyldings dy't MP5 sjen litte yn 'e luchtpijp fan in live anesthetisearre rat.(a) De magneet wurdt brûkt om ôfbyldings boppe en lofts fan 'e trachea te krijen, dan (b) nei it ferpleatsen fan de magneet nei rjochts.It reade fak jout de fergrutting oan dy't it kontrast fersterket.Dizze ôfbyldings binne fan 'e fideo te sjen yn's Supplementary Video fan S7: MP5.
Doe't de twa peallen waarden ôfstimd yn in noard-súd oriïntaasje boppe en ûnder de luchtpijp (dat wol sizze, oanlûken; Fig. 3b), de MP akkoarden ferskynden langer en sieten op 'e laterale muorre fan' e luchtpijp leaver as op 'e dorsale oerflak fan' e luchtpijp. trachea (sjoch taheakke).Fideo S9: MP5).Lykwols, hege konsintraasjes fan dieltsjes op ien side (dat wol sizze, it dorsale oerflak fan 'e trachea) waarden net ûntdutsen nei floeibere administraasje mei help fan in dûbele magneet apparaat, dat meastal foarkomt mei ien magneet apparaat.Dan, doe't ien magneet waard konfigurearre om tsjinoerstelde poalen ôf te slaan (figuer 3c), it oantal dieltsjes sichtber yn it sichtfjild net tanommen nei levering.It ynstellen fan beide twa magneetkonfiguraasjes is útdaagjend fanwegen de hege magnetyske fjildsterkte dy't respektivelik de magneten oanlûkt of triuwt.De opset waard doe feroare yn in inkele magneet parallel oan de luchtwegen, mar troch de luchtwegen troch in hoeke fan 90 graden, sadat de linen fan krêft de tracheale muorre ortogonaal krústen (figuer 3d), in oriïntaasje bedoeld om de mooglikheid fan dieltsjeaggregaasje te bepalen op de sydwand.observearre wurde.Yn dizze konfiguraasje wie d'r lykwols gjin identifisearbere MF-akkumulaasjebeweging of magneetbeweging.Op grûn fan al dizze resultaten waard in konfiguraasje mei in inkele magneet en in 30-graden oriïntaasje keazen foar in vivo stúdzjes fan gendragers (fig. 3a).
Doe't it bist meardere kearen ôfbylde waard fuort nei it minsklik offer, betsjutte it ûntbrekken fan interferearjende weefselbeweging dat fynere, koartere dieltsjelinen yn it dúdlike intercartilaginous fjild te ûnderskieden wiene, 'swaaiend' yn oerienstimming mei de translaasjebeweging fan 'e magneet.dúdlik sjen de oanwêzigens en beweging fan MP6 dieltsjes.
De titer fan LV-LacZ wie 1.8 x 108 IU / ml, en nei it mingjen fan 1: 1 mei CombiMag MP (MP6), waarden bisten ynjeksje mei 50 µl fan in tracheale dosis fan 9 x 107 IU / ml fan LV-auto (dus 4.5) x 106 TU/rat).).).Yn dizze stúdzjes, ynstee fan it ferpleatsen fan 'e magneet tidens arbeid, hawwe wy de magneet yn ien posysje fêstlein om te bepalen as LV-transduksje koe (a) wurde ferbettere yn ferliking mei fektorlevering by it ûntbrekken fan in magnetysk fjild, en (b) as de luchtwei koe wurde rjochte.De sellen wurde transduced yn 'e magnetyske doelgebieten fan' e boppeste luchtwegen.
De oanwêzigens fan magneten en it brûken fan CombiMag yn kombinaasje mei LV-fektors die bliken net negatyf te beynfloedzjen fan diersûnens, lykas ús standert LV-fektorleveringsprotokol.Frontale bylden fan 'e trachealregio ûnderwurpen oan meganyske fersteuring (Supplementary Fig. 1) lieten sjen dat de LV-MP behannele groep signifikant hegere nivo's fan transduksje hie yn 'e oanwêzigens fan in magneet (Fig. 9a).Allinich in lyts bedrach fan blauwe LacZ-kleuring wie oanwêzich yn 'e kontrôtgroep (figuer 9b).Kwantifikaasje fan X-Gal-bekleurde normalisearre regio's liet sjen dat administraasje fan LV-MP yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild resultearre yn in ûngefear 6-fâldige ferbettering (Fig. 9c).
Foarbyld fan gearstalde ôfbyldings dy't tracheale transduksje sjen litte mei LV-MP (a) yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild en (b) by it ûntbrekken fan in magneet.(c) Statistysk signifikante ferbettering yn it normalisearre gebiet fan LacZ-transduksje yn 'e trachea mei it brûken fan in magneet (*p = 0.029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± standertflater fan 'e gemiddelde).
Neutraal fluch read-bevlekte seksjes (foarbyld werjûn yn oanfoljende Fig. 2) oanjûn dat LacZ-bevlekte sellen wiene oanwêzich yn deselde stekproef en op deselde lokaasje as earder rapportearre.
De kaai útdaging yn luchtwei gen-terapy bliuwt de krekte lokalisaasje fan drager dieltsjes yn gebieten fan belang en it berikken fan in hege nivo fan transduction effisjinsje yn 'e mobile long yn' e oanwêzigens fan luchtstream en aktive mucus klaring.Foar LV-dragers dy't bedoeld binne foar de behanneling fan respiratoire sykten yn cystyske fibrose, is it fergrutsjen fan de ferbliuwstiid fan 'e dragerpartikels yn' e liedende luchtwegen oant no ta in ûnberikber doel west.As oanjûn troch Castellani et al., hat it gebrûk fan magnetyske fjilden om transduksje te ferbetterjen foardielen boppe oare metoaden foar genlevering, lykas elektroporaasje, om't it ienfâld, ekonomy, lokale levering, ferhege effisjinsje en koartere ynkubaasjetiid kin kombinearje.en mooglik in legere doasis fan vehicle10.Yn vivo ôfsetting en gedrach fan magnetyske dieltsjes yn 'e luchtwegen ûnder ynfloed fan eksterne magnetyske krêften is lykwols nea beskreaun, en feitlik is it fermogen fan dizze metoade om geneekspresjenivo's te ferheegjen yn yntakt libbene luchtwegen net yn vivo oantoand.
Us in vitro-eksperiminten op it PCXI-synchrotron lieten sjen dat alle dieltsjes dy't wy testen, mei útsûndering fan it MP-polystyrene, sichtber wiene yn 'e ôfbyldingsopstelling dy't wy brûkten.Yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild foarmje magnetyske fjilden snaren, wêrfan de lingte besibbe is oan it type dieltsjes en de sterkte fan it magnetysk fjild (dus de tichtby en beweging fan 'e magneet).Lykas werjûn yn figuer 10, wurde de stringen dy't wy observearje foarme as elk yndividueel dieltsje magnetisearre wurdt en syn eigen lokale magnetyske fjild induceart.Dizze aparte fjilden feroarsaakje oare ferlykbere dieltsjes om te sammeljen en te ferbinen mei groepstringbewegingen troch lokale krêften fan 'e pleatslike krêften fan attraksje en ôfwiking fan oare dieltsjes.
Diagram toant (a, b) keatlingen fan dieltsjes dy't foarmje binnen floeistoffolle kapillaren en (c, d) in lucht-folle trachea.Tink derom dat de kapillaren en trachea net op skaal tekene wurde.Panel (a) befettet ek in beskriuwing fan 'e MF mei Fe3O4 dieltsjes arranzjearre yn keatlingen.
Doe't de magneet oer de kapillair beweecht, berikte de hoeke fan 'e dieltsjestring de krityske drompel foar MP3-5 mei Fe3O4, wêrnei't de dieltsjestring net mear yn 'e oarspronklike posysje bleau, mar lâns it oerflak nei in nije posysje.magneet.Dit effekt komt wierskynlik foar om't it oerflak fan 'e glêzen kapillair glêd genôch is om dizze beweging te foarkommen.Ynteressant gedrage MP6 (CombiMag) har net op dizze manier, miskien om't de dieltsjes lytser wiene, in oare coating of oerflaklading hiene, of de proprietêre dragerfluid beynfloede har fermogen om te bewegen.It kontrast yn it CombiMag-dieltsjeôfbylding is ek swakker, wat suggerearret dat de floeistof en dieltsjes deselde tichtens hawwe kinne en dêrom net maklik nei elkoar kinne bewege.Partikels kinne ek fêst komme as de magneet te hurd beweecht, wat oanjout dat de magnetyske fjildsterkte de wriuwing tusken dieltsjes yn 'e floeistof net altyd kin oerwinne, wat suggerearret dat de magnetyske fjildsterkte en de ôfstân tusken de magneet en it doelgebiet net as in ferrassing.belangryk.Dizze resultaten jouwe ek oan dat hoewol magneten in protte mikropartikels kinne fange dy't troch it doelgebiet streame, it is net wierskynlik dat magneten kinne wurde fertroud om CombiMag-dieltsjes lâns it oerflak fan 'e trachea te ferpleatsen.Sadwaande konkludearren wy dat in vivo LV MF-stúdzjes statyske magnetyske fjilden moatte brûke om fysyk spesifike gebieten fan 'e luchtweibeam te rjochtsjen.
Sadree't de dieltsjes wurde levere yn it lichem, se binne lestich te identifisearjen yn 'e kontekst fan' e komplekse bewegende weefsel fan it lichem, mar harren opspoaren kapasiteit is ferbettere troch it ferpleatsen fan de magneet horizontaal oer de trachea te "wiggle" de MP snaren.Wylst real-time imaging mooglik is, is it makliker om dieltsjebeweging te ûnderskieden nei't it bist minsklik fermoarde is.MP-konsintraasjes wiene meastentiids it heechst op dit plak doe't de magneet waard pleatst oer de ôfbylding gebiet, hoewol't guon dieltsjes waarden meastal fûn fierder del de luchtpijp.Oars as in vitro-stúdzjes kinne dieltsjes net troch de beweging fan in magneet troch de luchtpijp dellutsen wurde.Dizze fynst is yn oerienstimming mei hoe't de slym dy't it oerflak fan 'e trachea beslacht, typysk ynademe dieltsjes ferwurket, se yn' e slym fange en dêrnei troch it muco-ciliêre klaringsmeganisme wiskje.
Wy hypoteze dat it brûken fan magneten boppe en ûnder de luchtpijp foar attraksje (Fig. 3b) koe resultearje yn in mear unifoarm magnetysk fjild, ynstee fan in magnetysk fjild dat is tige konsintrearre op ien punt, potinsjeel resultearret yn in mear unifoarm ferdieling fan dieltsjes..Us foarriedige stúdzje fûn lykwols gjin dúdlike bewiis om dizze hypoteze te stypjen.Lykas, it ynstellen fan in pear magneten om te repulsearjen (fig. 3c) resultearre net yn mear dieltsjes yn it byldgebiet.Dizze twa befinings litte sjen dat de opset mei dûbele magneet de lokale kontrôle fan MP-oanwizer net signifikant ferbetteret, en dat de resultearjende sterke magnetyske krêften lestich binne om te stimmen, wat dizze oanpak minder praktysk makket.Likegoed hat it oriïntearjen fan de magneet boppe en oer de trachea (figuer 3d) ek it oantal dieltsjes dat oerbleaun yn it ôfbylde gebiet net ferhege.Guon fan dizze alternative konfiguraasjes meie net súksesfol as se resultearje yn in reduksje fan de magnetyske fjild sterkte yn de deposition sône.Sa, de ienige magneet konfiguraasje op 30 graden (figuer 3a) wurdt beskôge as de ienfâldichste en meast effisjinte in vivo testmetoade.
De LV-MP-stúdzje liet sjen dat doe't LV-fektors waarden kombinearre mei CombiMag en levere nei't se fysyk fersteurd wiene yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild, transduksjenivo's signifikant tanommen yn' e trachea yn ferliking mei kontrôles.Op grûn fan synchrotron-ôfbyldingsstúdzjes en LacZ-resultaten die bliken dat it magnetyske fjild de LV yn 'e luchtpijp hâlde koe en it oantal fektorpartikels dy't fuortendaliks djip yn 'e long penetrearren ferminderje.Sokke ferbetterings fan doelen kinne liede ta hegere effisjinsje by it ferminderjen fan levere titers, net-rjochte transduksje, inflammatoare en ymmún-side-effekten, en kosten foar genoerdracht.Wichtich is, neffens de fabrikant, CombiMag kin brûkt wurde yn kombinaasje mei oare metoaden foar oerdracht fan gen, ynklusyf oare virale vectoren (lykas AAV) en nukleïnesoeren.