Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side werjaan sûnder stilen en JavaScript.
Toxoplasma gondii is in yntrazellulêre protozoa-parasyt dy't de mikroomjouwing fan 'e ynfekteare gasthear moduleart en it is bekend dat se assosjearre wurde mei de ynsidinsje fan groei fan harsentumor.Yn dizze stúdzje hypoteze wy dat exosomal miRNA-21 fan Toxoplasma-ynfeksje befoarderet groei fan harsentumor.Exosomes fan Toxoplasma-ynfekteare BV2 mikroglia waarden karakterisearre en ynternalisaasje fan U87 glioma-sellen waard befêstige.Eksosomale mikroRNA-ekspresjeprofilen waarden analysearre mei arrays fan microRNA en microRNA-21A-5p ferbûn mei Toxoplasma gondii en tumorsortering.Wy ûndersochten ek de mRNA-nivo's fan tumor-assosjearre genen yn U87-glioma-sellen troch it feroarjen fan miR-21-nivo's yn exosomen en it effekt fan exosomen op minsklike U87-glioma-selproliferaasje.Yn exosomes fan U87 glioma sellen ynfektearre mei Toxoplasma gondii, wurdt de ekspresje fan microRNA-21 ferhege en de aktiviteit fan antitumor genen (FoxO1, PTEN, en PDCD4) wurdt fermindere.BV2-ôflaat exosomen ynfektearre mei Toxoplasma induce proliferaasje fan U87 glioma sellen.Exosomes induce groei fan U87 sellen yn in mûs tumor model.Wy suggerearje dat ferhege exosomal miR-21 yn Toxoplasma-ynfekteare BV2-mikroglia in wichtige rol kin spylje as in selgroeipromotor yn U87-glioma-sellen troch antitumor-genen te downregulearjen.
It wurdt rûsd dat mear dan 18,1 miljoen gefallen fan avansearre kanker wrâldwiid waarden diagnostisearre yn 2018, mei sawat 297,000 tumors fan it sintrale senuwstelsel elk jier diagnostisearre (1,6% fan alle tumors)1.Earder ûndersyk hat oantoand dat risikofaktoaren foar it ûntwikkeljen fan minsklike harsentumoren ferskate gemyske produkten, famyljeskiednis en ionisearjende strieling omfetsje fan kopterapeutyske en diagnostyske apparatuer.De krekte oarsaak fan dizze maligniteiten is lykwols ûnbekend.Likernôch 20% fan alle kankers wrâldwiid wurde feroarsake troch ynfekteare aginten, ynklusyf firussen, baktearjes en parasiten3,4.Ynfeksjeare sykteferwekkers fersteure de genetyske meganismen fan 'e gasthearsel, lykas DNA-reparaasje en de selsyklus, en kinne liede ta chronike ûntstekking en skea oan it ymmúnsysteem5.
Ynfeksjeare aginten ferbûn mei minsklike kanker binne de meast foarkommende firale patogenen, ynklusyf minsklike papillomafirussen en hepatitis B- en C-firussen.Parasiten kinne ek in potinsjele rol spylje yn 'e ûntwikkeling fan minsklike kanker.Ferskate parasytsoarten, nammentlik Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis en Hymenolepis nana, binne belutsen by ferskate soarten minsklike kanker 6,7,8.
Toxoplasma gondii is in intracellular protozoan dat de mikroomjouwing fan ynfekteare hostsellen regelet.Dizze parasyt wurdt rûsd om sawat 30% fan 'e wrâldbefolking te ynfektearjen, wêrtroch't de heule befolking yn risiko's9,10 is.Toxoplasma gondii kin fitale organen ynfektearje, ynklusyf it sintrale senuwstelsel (CNS), en feroarsaakje serieuze sykten lykas fatale meningitis en encephalitis, fral yn ymmúnkompromittearre pasjinten9.Toxoplasma gondii kin lykwols ek de omjouwing fan 'e ynfekteare host feroarje troch modulearjen fan selgroei en ymmúnreaksjes yn immunokompetinte yndividuen, wat liedt ta it ûnderhâld fan in asymptomatyske chronike ynfeksje9,11.Nijsgjirrich, sjoen de korrelaasje tusken T. gondii prevalens en harsentumor ynsidinsje, guon rapporten suggerearje dat in vivo host miljeu feroarings fanwege groanyske T. gondii ynfeksje lykje op de tumor mikroomjouwing.
Eksosomen binne bekend as ynterzellulêre kommunikators dy't biologyske ynhâld leverje, ynklusyf aaiwiten en nukleïnesoeren, fan oanbuorjende sellen16,17.Exosomes kinne tumor-relatearre biologyske prosessen beynfloedzje, lykas anty-apoptose, angiogenesis, en metastasis yn 'e tumormikro-omjouwing.Benammen miRNA's (miRNA's), lytse net-kodearjende RNA's oer 22 nukleotiden yn 'e lingte, binne wichtige post-transkripsjonele genregulators dy't mear as 30% fan minsklik mRNA kontrolearje fia it miRNA-induzearre silencing kompleks (miRISC).Toxoplasma gondii kin biologyske prosessen fersteure troch it kontrolearjen fan miRNA-ekspresje yn ynfekteare hosts.Host miRNA's befetsje wichtige sinjalen foar it regulearjen fan biologyske prosessen fan host om de survivalstrategy fan 'e parasyt te berikken.Sa kin it bestudearjen fan feroaringen yn it host miRNA-profyl by ynfeksje mei T. gondii ús helpe om de ynteraksje tusken de host en T. gondii dúdliker te begripen.Indeed, Thirugnanam et al.15 suggerearre dat T. gondii harsenskarsinogenese befoarderet troch har ekspresje te feroarjen op spesifike host miRNA's dy't ferbûn binne mei tumorgroei en fûn dat T. gondii glioma's yn eksperimintele bisten feroarsaakje kin.
Dizze stúdzje rjochtet him op 'e feroaring fan exosomal miR-21 yn host mikroglia ynfekteare mei Toxoplasma BV2.Wy observearre in mooglike rol fan feroare exosomal miR-21 yn 'e groei fan U87 glioma-sellen fanwege it behâld yn' e kearn fan FoxO1 / p27, dat is it doel fan overexpressed miR-21.
Exosomen ôflaat fan BV2 waarden krigen mei differinsjaal sintrifugaasje en validearre troch ferskate metoaden om kontaminaasje te foarkommen mei sellulêre komponinten of oare vesicles.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) toande ûnderskate patroanen tusken aaiwiten extracted út BV2 sellen en exosomes (figuer 1A), en samples waarden beoardiele foar de oanwêzigens fan Alix, dat waard analysearre troch Western blotting fan exosomal protein markers yn.Alix-labeling waard fûn yn exosomeproteinen, mar net yn BV2-sellysatproteinen (Fig. 1B).Derneist waard suvere RNA fan exosomen ôflaat fan BV2 analysearre mei in bioanalyzer.18S en 28S ribosomale subunits waarden komselden waarnommen yn it exosomal RNA-migraasjepatroan, wat oanjout op betroubere suverens (figuer 1C).Uteinlik liet transmissieelektronenmikroskopie sjen dat de waarnommen eksosomen sawat 60-150 nm yn grutte wiene en in beker-like struktuer hawwe dy't typysk is foar exosome morfology (Fig. 1D).
Karakterisaasje fan exosomen ôflaat fan BV2-sellen.(A) Side mei feiligensgegevens.Proteins waarden isolearre út BV2-sellen as exosomen ôflaat fan BV2.Proteinpatroanen ferskille tusken sellen en exosomen.(B) Western blot analyze fan in exosomal marker (Alix).(C) Evaluaasje fan suvere RNA út BV2-sellen en BV2-ôflaat exosomen mei in bioanalyzer.Sa waarden 18S en 28S ribosomale subunits yn BV2-sellen selden fûn yn exosomal RNA.(D) Transmission elektroanenmikroskopie liet sjen dat exosomen isolearre fan BV2-sellen negatyf waarden kleurd mei 2% uranylacetat.Eksosomen binne sawat 60-150 nm yn grutte en bekerfoarmich (Song en Jung, net-publisearre gegevens).
Sellulêre ynternalisaasje fan BV2-ôflaat exosomen yn U87 minsklike glioma-sellen waard waarnommen mei konfokale mikroskopy.PKH26-markearre exosomen binne lokalisearre yn it cytoplasma fan U87-sellen.Nuclei waarden kleurd mei DAPI (Fig. 2A), wat oanjout dat BV2-ôflaat exosomes kinne wurde internalized troch host sellen en beynfloedzje de omjouwing fan ûntfanger sellen.
Internalisaasje fan BV2-ôflaat exosomen yn U87-glioma-sellen en BV2-ôflaat exosomen ynfekteare mei Toxoplasma RH feroarsake proliferaasje fan U87-glioma-sellen.(A) Exosomen opslokt troch U87-sellen mjitten troch konfokale mikroskopy.U87 glioma-sellen waarden ynkubeare mei exosomen markearre mei PKH26 (read) of sûnder kontrôle foar 24 oeren.De kearnen waarden kleurd mei DAPI (blau) en dêrnei beoardiele ûnder in konfokale mikroskoop (skaalbalke: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma-selproliferaasje waard bepaald troch selproliferaasje-assay.U87 glioma sellen waarden behannele mei exosomes foar de oantsjutte tiid. *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 troch Student's t-test. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 krigen mei help fan Student's t-test.
Nei it befêstigjen fan de ynternalisaasje fan BV2-ôflaat exosomen yn U87-glioma-sellen, hawwe wy selproliferaasje-assays útfierd om de rol fan BV2-ôflaat Toxoplasma-ôflaat exosomen te ûndersykjen yn 'e ûntwikkeling fan minsklike glioma-sellen.Behanneling fan U87-sellen mei exosomen fan T. gondii-ynfekteare BV2-sellen liet sjen dat T. gondii-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen in signifikant hegere proliferaasje fan U87-sellen feroarsake yn ferliking mei kontrôle (Fig. 2B).
Dêrnjonken hie groei fan U118-sellen deselde resultaten as U87, om't Toxoplasma stimulearre eksosomen de heechste nivo's fan proliferaasje feroarsake (gegevens net werjûn).Op grûn fan dizze gegevens kinne wy ​​oanjaan dat BV2-ôflaat Toxoplasma-ynfekteare exosomen in wichtige rol spylje yn glioma-selproliferaasje.
Om it effekt te ûndersykjen fan Toxoplasma-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen op tumorûntwikkeling, ynjeksje wy U87 glioma-sellen yn bleate mûzen foar in xenograftmodel en ynjeksjeare BV2-ôflaat exosomen of RH-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen.Nei't tumors nei 1 wike dúdlik waarden, waard elke eksperimintele groep fan 5 mûzen ferdield neffens tumorgrutte om itselde begjinpunt te bepalen, en tumorgrutte waard 22 dagen mjitten.
Yn mûzen mei it U87 xenograft-model waarden signifikant gruttere tumorgrutte en gewicht beoardiele yn 'e BV2-ôflaat RH-ynfekteare exosome-groep op dei 22 (Fig. 3A, B).Oan 'e oare kant wie d'r gjin signifikant ferskil yn tumorgrutte tusken de BV2-ôflaat exosome-groep en de kontrôtgroep nei exosome-behanneling.Derneist, mûzen ynjeksje mei glioma sellen en exosomes visueel werjûn de grutste tumor folume yn 'e groep fan RH-ynfektearre BV2-ôflaat exosomes (Fig. 3C).Dizze resultaten litte sjen dat BV2-ôflaat Toxoplasma-ynfekteare exosomen gliomagroei yn in mûstumormodel inducearje.
Onkogenesis (AC) fan BV2-ôflaat exosomen yn in U87 xenograft mûsmodel.Tumorgrutte (A) en gewicht (B) waarden signifikant ferhege yn BALB / c neakenmûzen behannele mei RH-ynfekteare exosomen ôflaat fan BV2.BALB / c neakenmûzen (C) waarden subkutan ynjeksje mei 1 x 107 U87-sellen ophongen yn Matrigel-mingsel.Seis dagen nei ynjeksje waarden 100 μg fan BV2-ôflaat exosomes behannele yn mûzen.Tumorgrutte en gewicht waarden respektivelik mjitten op 'e oantsjutte dagen en nei it offer. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
De gegevens lieten sjen dat 37 miRNAs (16 overexpressed en 21 downexpressed) ferbûn mei ymmuniteit of tumorûntwikkeling waarden signifikant feroare yn mikroglia nei ynfeksje mei de Toxoplasma RH-stam (Fig. 4A).Relative ekspresjenivo's fan miR-21 ûnder feroare miRNA's waarden befêstige troch real-time RT-PCR yn exosomen ôflaat fan BV2, exosomen behannele mei BV2- en U87-sellen.Ekspresje fan miR-21 toande in signifikante ferheging fan eksosomen fan BV2-sellen ynfekteare mei Toxoplasma gondii (RH-stam) (Fig. 4B).Relative ekspresjenivo's fan miR-21 yn BV2- en U87-sellen ferhege nei opname fan feroare eksosomen (Fig. 4B).De relative nivo's fan miR-21-ekspresje yn 'e harsensweefsels fan tumorpasjinten en mûzen ynfekteare mei Toxoplasma gondii (ME49-stam) wiene respektivelik heger as yn kontrôles (Fig. 4C).Dizze resultaten korrelearje mei ferskillen tusken de ekspresjenivo's fan foarseine en befêstige mikroRNA's in vitro en in vivo.
Feroaringen yn 'e ekspresje fan exosomal miP-21a-5p yn mikroglia ynfekteare mei Toxoplasma gondii (RH).(A) Toant wichtige feroaringen yn siRNA ferbûn mei immuniteit of tumorûntwikkeling nei T. gondii RH-ynfeksje.(B) Relative miR-21-ekspresjenivo's waarden ûntdutsen troch real-time RT-PCR yn BV2-ôflaat exosomen, BV2-behannele exosomes, en U87-sellen.(C) Relative miR-21-ekspresjenivo's waarden fûn yn 'e harsensweefsels fan tumorpasjinten (N = 3) en mûzen ynfekteare mei Toxoplasma gondii (ME49-stam) (N = 3). *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P < 0,05 t-kriteria-beheining. *P <0.05 waard krigen mei Student's t-test. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 krigen mei help fan Student's t-test.
Eksosomen fan RH-ynfekteare BV2-sellen liede ta de groei fan glioma's yn vivo en in vitro (figuer 2, 3).Om relevante mRNA's te detektearjen, ûndersochten wy mRNA-nivo's fan antitumor-doelgenen, forkheadbox O1 (FoxO1), PTEN, en programmearre seldea 4 (PDCD4) yn U87-sellen ynfekteare mei exosomen ôflaat fan BV2 of RH BV2.Bioinformatika-analyze hat oantoand dat ferskate tumor-assosjearre genen, ynklusyf de FoxO1-, PTEN- en PDCD4-genen, miR-2121,22-binende siden hawwe.mRNA-nivo's fan antitumor-doelgenen waarden fermindere yn RH-ynfekteare BV2-ôflaat exosomes yn ferliking mei BV2-ôflaat exosomen (Fig. 5A).FoxO1 toande fermindere proteïnenivo's yn RH-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen yn ferliking mei BV2-ôflaat exosomen (figuer 5B).Op grûn fan dizze resultaten kinne wy ​​​​befêstigje dat exosomen ôflaat fan RH-ynfekteare BV2 anty-onkogene genen downregulearje, en behâlde har rol yn tumorgroei.
Toxoplasma RH-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen induce ûnderdrukking fan antitumor-genen yn U87 glioma-sellen troch Toxoplasma RH-ynfekteare BV2-ôflaat exosomen.(A) Real-time PCR fan FoxO1, PTEN en PDCD4 ekspresje yn eksosomen ôflaat fan T. gondii RH-ynfekteare BV2 yn ferliking mei PBS exosomes.β-actin mRNA waard brûkt as kontrôle.(B) FoxO1-ekspresje waard bepaald troch Western blotting en densitometriegegevens waarden statistysk evaluearre mei it ImageJ-programma. *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P <0.05 waard krigen troch Student's t-test. *P < 0,05 t-kriteria-beheining. *P <0.05 waard krigen mei Student's t-test. *P < 0.05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 krigen mei help fan Student's t-test.
Om it effekt fan miP-21 yn eksosomen te begripen op tumor-assosjearre genregulaasje, waarden U87-sellen transfekteare mei in ynhibitor fan miP-21 mei help fan Lipofectamine 2000 en de sellen waarden rispe 24 oeren nei transfeksje.FoxO1- en p27-ekspresjenivo's yn sellen transfekteare mei miR-21-ynhibitoren waarden fergelike mei sellen behannele mei BV2-ôflaat exosomen mei qRT-PCR (Fig. 6A,B).Transfeksje fan 'e miR-21 inhibitor yn U87 sellen signifikant downregulated FoxO1 en p27 ekspresje (Fig. 6).
RH-ynfekteare exosomal BV2-ôflaat miP-21 feroare FoxO1 / p27-ekspresje yn U87-glioma-sellen.U87-sellen waarden transfekteare mei miP-21-ynhibitor mei Lipofectamine 2000 en sellen waarden 24 oeren nei transfeksje rispe.FoxO1- en p27-ekspresjenivo's yn sellen transfekteare mei miR-21-ynhibitoren waarden fergelike mei nivo's yn sellen behannele mei BV2-ôflaat exosomen mei qRT-PCR (A, B).
Om de ymmúnreaksje fan 'e gasthear te ûntkommen, feroaret de Toxoplasma-parasyt yn in weefselcyste.Se parasitearje ferskate weefsels, ynklusyf it harsens, it hert en de skeletspier, yn 'e hiele libben fan' e gasthear en moduleare de ymmúnreaksje fan 'e gasthear.Dêrnjonken kinne se de selsyklus en apoptose fan hostsellen regelje, har proliferaasje befoarderje14,24.Toxoplasma gondii ynfektearret foaral host dendrityske sellen, neutrophilen, en monocyte / macrophage lineage, ynklusyf brain microglia.Toxoplasma gondii induces de differinsjaasje fan makrofagen fenotype M2, beynfloedet wûne genêzing nei pathogen ynfeksje, en is ek assosjearre mei hypervaskularization en granulomatous fibrosis.Dizze gedrachspatogenese fan Toxoplasma-ynfeksje kin relatearre wurde oan markers ferbûn mei tumorûntwikkeling.De fijannige omjouwing regele troch Toxoplasma kin lykje op de oerienkommende precancer.Dêrom kin oannommen wurde dat Toxoplasma-ynfeksje moat bydrage oan 'e ûntwikkeling fan harsentumoren.Yn feite binne hege tariven fan Toxoplasma-ynfeksje rapporteare yn it serum fan pasjinten mei ferskate harsentumoren.Derneist kin Toxoplasma gondii in oare karzinogene effektor wêze en synergistysk hannelje om oare ynfekteare karzinogenen te helpen ûntwikkeljen fan harsentumors.Yn dit ferbân is it de muoite wurdich op te merken dat P. falciparum en Epstein-Barr-firus synergistysk bydrage oan de foarming fan Burkitt's lymphoma.
De rol fan exosomen as regulators op it mêd fan kankerûndersyk is wiidweidich ûndersocht.De rol fan eksosomen tusken parasiten en ynfekteare hosts bliuwt lykwols min begrepen.Oant no ta hawwe ferskate tafersjochhâlders, ynklusyf sekreteare aaiwiten, de biologyske prosessen ferklearre wêrby't protozoa-parasiten de hostoanfal fersette en ynfeksje behâlde.Koartlyn is d'r in groeiende konsept west dat protozoa-assosjearre mikrovesikels en har mikroRNA's ynteraksje mei hostsellen om in geunstige omjouwing te meitsjen foar har oerlibjen.Dêrom binne fierdere stúdzjes nedich om de relaasje te ûntdekken tusken feroare exosomal miRNA's en glioma-selproliferaasje.MicroRNA-feroaring (klustergenen miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 en miR-17-92) bindet oan de STAT3-promotor yn toxoplasma-ynfekteare minsklike makrofagen, wurdt regele en induceart anty -apoptosis yn antwurd op Toxoplasma gondii-ynfeksje 29.Toxoplasma-ynfeksje fergruttet de ekspresje fan miR-17-5p en miR-106b-5p, dy't ferbûn binne mei ferskate hyperproliferative sykten 30.Dizze gegevens suggerearje dat host miRNA's regele troch Toxoplasma-ynfeksje wichtige molekulen binne foar parasyt-oerlibjen en patogenese yn biologysk gedrach fan host.
Feroare miRNA's kinne ferskate soarten gedrach beynfloedzje tidens it inisjearjen en foarútgong fan maligne sellen, ynklusyf gliomas: selsfoldwaan fan groeisinjalen, ûnsensitiviteit foar groei-ynhiberende sinjalen, apoptose-ûntdûking, ûnbeheind replikatyf potinsjeel, angiogenesis, ynvaazje en metastasis, en ûntstekking.Yn glioma binne feroare miRNA's identifisearre yn ferskate ekspresjeprofileringsstúdzjes.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje befêstige wy hege nivo's fan miRNA-21-ekspresje yn toxoplasma-ynfekteare hostsellen.miR-21 is identifisearre as ien fan 'e meast oerekspresjeare microRNA's yn solide tumors, ynklusyf gliomas, 33 en har ekspresje korreleart mei de graad fan glioma.Akkumulearjende bewiis suggerearret dat miR-21 in nij onkogen is dat fungearret as in anty-apoptotyske faktor yn glioma-groei en is tige oerútdrukt yn weefsels en plasma fan minsklike harsensmalignaasjes.Ynteressant triggert miR-21-ynaktivaasje yn glioma-sellen en weefsels de ynhibysje fan selproliferaasje troch kaspase-ôfhinklike apoptose.Bioinformatyske analyze fan miR-21 foarsizze doelen iepenbiere meardere tumor-suppressor-genen ferbûn mei apoptose-paden, ynklusyf programmearre seldea 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, en forkhead box O1 (FoxO1), mei de miR-2121 binende side..22.38.
FoxO1, as ien fan 'e transkriptyfaktoaren (FoxO), is belutsen by de ûntwikkeling fan ferskate soarten minsklike kanker en kin de ekspresje fan tumor-suppressor-genen regelje lykas p21, p27, Bim en FasL40.FoxO1 kin bine en aktivearje sel syklus ynhibitoren lykas p27 te ûnderdrukke sel groei.Boppedat is FoxO1 in wichtige effektor fan PI3K / Akt-sinjalearjen en regelet in protte biologyske prosessen lykas selsyklusprogression en seldifferinsjaasje troch aktivearring fan p2742-transkripsje.
Ta beslút, wy leauwe dat exosomal miR-21 ôflaat fan Toxoplasma-ynfektearre microglia kin spylje in wichtige rol as in groei regulator fan glioma sellen (Fig. 7).Fierdere stúdzjes binne lykwols nedich om in direkte ferbining te finen tusken exosomal miR-21, feroare Toxoplasma-ynfeksje, en glioma-groei.Dizze resultaten wurde ferwachte dat se in útgongspunt leverje foar it bestudearjen fan de relaasje tusken Toxoplasma-ynfeksje en de ynsidinsje fan glioma.
In skematysk diagram fan it meganisme fan glioma (brain) karsinogenese wurdt foarsteld yn dizze stúdzje.De skriuwer tekenet yn PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle eksperimintele protokollen yn dizze stúdzje, ynklusyf it gebrûk fan bisten, wiene yn oerienstimming mei de Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines en waarden goedkard troch de Institutional Review Board fan 'e Seoul National University School of Medicine (IRB nûmer SNU- 150715).-2).Alle eksperimintele prosedueres waarden útfierd yn oerienstimming mei oanbefellings fan ARRIVE.
BV2 mûsmicroglia en U87 minsklike glioma-sellen waarden respektivelik kweekt yn Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) en Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), elk mei 10% fetale bovine serum, 4 mM l- glutamine, 0,2 mM penicilline en 0,05 mM streptomycin.Sellen waarden kultivearre yn in ynkubator mei 5% CO2 by 37 ° C.In oare glioma-selline, U118, waard brûkt foar fergeliking mei U87-sellen.
Om exosomen te isolearjen fan T. gondii-ynfekteare RH- en ME49-stammen, waarden T. gondii-tachyzoites (RH-stam) rispe út 'e abdominale kavity fan 6-wiken-âlde BALB / c-mûzen dy't 3-4 dagen foarôf ynjeksje.Tachyzoites waarden trije kear wosken mei PBS en suvere troch centrifugaasje yn 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Om tachyzoites fan stam ME49 te krijen, waarden BALB / c-mûzen intraperitoneaal ynjeksje mei 20 tissue-cysten en tachyzoite-transformaasje yn cysten waard sammele troch it waskjen fan 'e abdominale holte op' e 6-8e dei nei ynfeksje (PI).Mûzen ynfekteare mei PBS.ME49 tachyzoites waarden groeid yn sellen oanfolle mei 100 μg/ml penicilline (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL), en 5% fetale bovine serum (Lonza, Walkersville, MD) .., Feriene Steaten) by 37 °C en 5% koalstofdiokside.Nei kultivaasje yn Vero-sellen waarden ME49-tachyzoites twa kear troch in 25 gauge needle en dan troch in 5 µm filter trochjûn om pún en sellen te ferwiderjen.Nei it wassen waarden de tachyzoiten opnij suspendearre yn PBS44.Tissue-cysten fan Toxoplasma gondii-stam ME49 waarden ûnderhâlden troch intraperitoneale ynjeksje fan cysten isolearre út it harsens fan ynfekteare C57BL/6-mûzen (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).De harsens fan ME49-ynfekteare mûzen waarden nei 3 moannen fan PI rispe en ûnder in mikroskoop mingd om cysten te isolearjen.De ynfekteare mûzen waarden hâlden ûnder spesjale pathogenfrije omstannichheden (SPF) oan 'e Seoul National University School of Medicine.
Totaal RNA waard ekstrahearre út BV2-ôflaat exosomes, BV2-sellen en weefsels mei de miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Dútslân) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant, ynklusyf de ynkubaasjetiid foar de elueringsstap.De RNA-konsintraasje waard bepaald op in NanoDrop 2000 spektrofotometer.De kwaliteit fan RNA-mikroarrays waard beoardiele mei in Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederlân).
DMEM mei 10% exosome-earme FBS waard taret troch ultracentrifugaasje by 100.000g foar 16 oeren by 4 ° C en filtere troch in 0.22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2-sellen, 5 × 105, waarden kultivearre yn DMEM mei 10% exosome-depleted FBS en 1% antibiotika by 37 ° C en 5% CO2.Nei 24 oeren fan ynkubaasje waarden tachyzoites fan stam RH of ME49 (MOI = 10) oan 'e sellen tafoege en net-ynfallende parasiten waarden binnen in oere fuortsmiten en opnij fol mei DMEM.Exosomen fan BV2-sellen waarden isolearre troch modifisearre differinsjaal sintrifugaasje, de meast brûkte metoade.Resuspendearje de exosome pellet yn 300 µl PBS foar RNA- as proteïne-analyse.De konsintraasje fan isolearre eksosomen waard bepaald mei in BCA-protein-assay-kit (Pierce, Rockford, IL, USA) en in NanoDrop 2000 spektrofotometer.
Precipitaten fan BV2-sellen as exosomen ôflaat fan BV2 waarden lysearre yn PRO-PREP ™ proteïne-ekstraksje-oplossing (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) en aaiwiten waarden laden op Coomassie briljant blau kleurde 10% SDS polyacrylamide gels.Derneist waarden aaiwiten oerbrocht nei PVDF-membranen foar 2 oeren.Western blots waarden falidearre mei it Alix-antybody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) as in exosomal marker.HRP-konjugearre geit anty-mûs IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, Feriene Steaten) en in LAS-1000 plus luminescent image analyzer (Fuji Photographic Film, Tokio, Japan) waarden brûkt as sekundêr antykodym..Transmission elektroanenmikroskopie waard útfierd om de grutte en morfology fan exosomes te studearjen.Exosomen isolearre út BV2-sellen (6.40 µg / µl) waarden taret op koalstof-coated meshes en negatyf kleurde mei 2% uranylacetat foar 1 min.De tariede samples waarden waarnommen by in fersnellende spanning fan 80 kV mei in JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) útrist mei in ES1000W Erlangshen CCD-kamera (Gatan, Pleasanton, CA, Feriene Steaten).
BV2-ôflaat eksosomen waarden kleurd mei de PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) foar 15 minuten by keamertemperatuer.U87-sellen, 2 × 105, mei PKH26-markearre exosomen (read) as gjin eksosomen as negative kontrôle, waarden 24 oeren by 37 ° C ynkubeare yn in 5% CO2-inkubator.U87-selkearnen waarden kleurd mei DAPI (blau), U87-sellen waarden fêstmakke yn 4% paraformaldehyde foar 15 min by 4 ° C en dêrnei analysearre yn in Leica TCS SP8 STED CW konfokaal mikroskoopsysteem (Leica Microsystems, Mannheim, Dútslân).observable.
cDNA waard synthesized út siRNA mei help fan Mir-X siRNA earste strân synteze en SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Real-time kwantitative PCR waard útfierd mei it iQ5 real-time PCR-deteksjesysteem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mei primers en sjabloanen mingd mei SYBR Premix.DNA waard fersterke foar 40 syklusen fan denaturaasje by 95 ° C foar 15 s en annealing by 60 ° C foar 60 s.De gegevens fan elke PCR-reaksje waarden analysearre mei de data-analysemodule fan 'e iQ ™ 5 optyske systeemsoftware (Bio-Rad).Relative feroaringen yn gene ekspresje tusken selektearre doelgenen en β-actin / siRNA (en U6) waarden berekkene mei de standert kromme metoade.De brûkte primer-sekwinsjes wurde werjûn yn Tabel 1.
3 x 104 U87 glioma sellen waarden sied yn 96-well platen en mingd mei Toxoplasma-ynfektearre exosomes ôflaat fan BV2 (50 μg / ml) of nonpulse exosomes ôflaat fan BV2 (50 μg / ml) as kontrôles op 12, 18 en 36 oeren .De selproliferaasjerate waard bepaald mei de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (Supplementary Figures S1-S3) 46.
5-wiken-âlde froulike BALB / c neakenmûzen waarden kocht fan Orient Bio (Seongnam-si, Súd-Korea) en yndividueel hâlden yn sterile kaaien by keamertemperatuer (22±2 °C) en fochtigens (45±15 °C).%) by keamertemperatuer (22±2°C) en fochtigens (45±15%).In 12-oere ljochtsyklus en in 12-oere donkere syklus waarden útfierd ûnder SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Mûzen waarden willekeurich ferdield yn trije groepen fan 5 mûzen elk en alle groepen waarden subkutan ynjeksje mei 400 ml PBS mei 1 x 107 U87 glioma-sellen en groeifaktor fermindere BD Matrigel ™ (BD Science, Miami, FL, USA).Seis dagen nei tumor-ynjeksje waarden 200 mg exosomen ôflaat fan BV2-sellen (mei / sûnder Toxoplasma-ynfeksje) yn 'e tumorsite ynjeksje.Twaentweintich dagen nei tumor-ynfeksje waard de tumorgrutte fan mûzen yn elke groep trije kear yn 'e wike metten mei in caliper, en it tumorvolumint waard berekkene troch de formule: 0,5 × (breedte) × 2 × lingte.
MicroRNA ekspresje analyze mei help fan miRCURYTM LNA miRNA array, 7e generaasje hat, mmu en rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Denemarken) covering 1119 goed karakterisearre mûzen ûnder 3100 minske, mûs en rat miRNA capture sondes.Tidens dizze proseduere waard 250 oant 1000 ng fan totaal RNA fan 'e 5'-fosfaat fuortsmiten troch behanneling mei kalfintestinale alkaline fosfatase folge troch labeling mei Hy3 griene fluorescent kleurstof.De markearre samples waarden dêrnei hybridisearre troch it laden fan mikroarray-slides mei in hybridisaasjekeamerkit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) en in hybridisaasje-slide-kit (Agilent Technologies).Hybridisaasje waard útfierd foar 16 oeren by 56 ° C, dan waarden de mikroarrays wosken yn oerienstimming mei de oanbefellings fan de fabrikant.De ferwurke mikroarray-dia's waarden doe skansearre mei in Agilent G2565CA mikroarray-scannersysteem (Agilent Technologies).Skande ôfbyldings waarden ymportearre mei Agilent Feature Extraction software ferzje 10.7.3.1 (Agilent Technologies) en de fluorescinsje-yntensiteit fan elke ôfbylding waard kwantifisearre mei it oerienkommende GAL-bestân fan it wizige Exiqon-protokol.Microarray-gegevens foar de hjoeddeistige stúdzje wurde dellein yn 'e GEO-database ûnder tagongsnûmer GPL32397.
Ekspresjeprofilen fan folwoeksen exosomal miRNA's yn mikroglia fan RH- as ME49-stammen ynfekteare mei Toxoplasma waarden analysearre mei ferskate netwurk-ark.miRNA's ferbûn mei tumorûntwikkeling waarden identifisearre mei miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) en filtere út mei normalisearre sinjaalintensiteit (log2) grutter dan 8.0.Under miRNAs, differinsjaal útdrukt miRNAs waarden fûn te wêzen mear as 1.5-fold feroare troch filter analyze fan miRNAs feroare troch RH of ME49 stammen ynfektearre mei T. gondii.
Sellen waarden sied yn seis-well platen (3 x 105 sellen / goed) yn opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) mei help Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Feriene Steaten).De transfekteare sellen waarden 6 oeren yn kultuer brocht en dêrnei waard it medium feroare yn frisse folslein medium.Sellen waarden rispe 24 oeren nei transfeksje.
Statistyske analyze waard benammen útfierd mei help fan Student's t-test mei Excel-software (Microsoft, Washington, DC, FS).Foar eksperimintele dieranalyse waard in twa-wei ANOVA útfierd mei Prism 3.0-software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-wearden <0.05 waarden beskôge as statistysk signifikant. P-wearden <0.05 waarden beskôge as statistysk signifikant. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-wearden <0.05 waarden statistysk signifikant beskôge. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-wearden <0.05 waarden statistysk signifikant beskôge.
Alle eksperimintele protokollen brûkt yn dizze stúdzje waarden goedkard troch de Institutional Review Board fan de Seoul National University School of Medicine (IRB nûmer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Skatte wrâldwide kankerynsidinsje en mortaliteit yn 2018: GLOBOCAN boarnen en metoaden.Ynterpretaasje.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS In ynsjoch yn 'e risikofaktoaren fan harsentumors en har therapeutyske yntervinsjes. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS In ynsjoch yn 'e risikofaktoaren fan harsentumors en har therapeutyske yntervinsjes.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS In oersjoch fan risikofaktoaren foar harsentumors en grutte therapeutyske yntervinsjes. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Djip begryp fan risikofaktoaren foar harsentumor en therapeutyske yntervinsjes.Rashid, S., Rehman, K. en Akash, MS In oersjoch fan risikofaktoaren foar harsentumors en grutte therapeutyske yntervinsjes.Biomedyske wittenskip.Apteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriële-virale ynteraksjes yn minsklike orodigestive en froulike genital trakte-kankers: in gearfetting fan epidemiologyske en laboratoariumbewiis. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriële-virale ynteraksjes yn minsklike orodigestive en froulike genital trakte-kankers: in gearfetting fan epidemiologyske en laboratoariumbewiis.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bakteriële-virale ynteraksjes yn kanker fan 'e minsklike gastrointestinale traktaat en froulike genital traktaat: in gearfetting fan epidemiologyske en laboratoariumgegevens. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-virale ynteraksje yn minsklike mûnlinge holte digestion en froulike reproduktive traktaat: gearfetting fan populêre syktewittenskip en laboratoariumbewiis.Kato I., Zhang J. en Sun J. Bakteriële-virale ynteraksjes yn minsklike gastrointestinale kanker en froulike genitalkanker: in gearfetting fan epidemiologyske en laboratoariumgegevens.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Fan ynfeksje nei kanker: Hoe DNA-tumorfirussen feroarje host-sel sintrale koalstof en lipidemetabolisme. Magon, KL & Parish, JL Fan ynfeksje nei kanker: Hoe DNA-tumorfirussen feroarje host-sel sintrale koalstof en lipidemetabolisme.Mahon, KL, en Parish, JL. Brânynfeksje foar kanker: hoe DNA-basearre tumorfirussen de sintrale koalstof en lipidemetabolisme feroarje. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Fan ynfeksje nei kanker: hoe't DNA-tumorfirussen de sintrale koalstof en lipidemetabolisme feroarje.Mahon, KL, en Parish, JL Fires ynfeksje foar kanker: hoe't DNA-tumorfirussen sintrale koalstof- en lipidemetabolisme yn hostsellen feroarje.Open Biology.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catechol estrogens fan schistosomes en lever flukes en helminth-assosjearre kanker.front.waarm binnen.5, 444 (2014).