Giardia duodenum is in parasitêr organisme dat giardiasis feroarsaket, in darmynfeksje dy't fral gewoan is by jonge bern mei klinyske tekens fan diarree.Wy hawwe earder rapportearre dat ekstrazellulêre G. duodenalis de aktivearring fan intrazellulêre oligomerisaasje-like receptor 3 (NLRP3) binende nukleotiden trigger en regelet gasthear inflammatoare antwurden troch ekstrazellulêre fesikel (EV) sekretion.De krekte molekulêre patroanen fan 'e pathogen-assosjearre duodenococcal EV (GEV) belutsen by dit proses en de rol fan it NLRP3-inflammasome yn giardiasis bliuwe lykwols te ferklearjen.
Rekombinante eukaryotyske ekspresjeplasmiden pcDNA3.1 (+) -alpha-2 en alpha-7.3 giardins yn GEV waarden konstruearre, transfekteare yn mûs primêre peritoneale makrofagen, en ûntdutsen troch it mjitten fan it ûntstekkingsdoelmolekule caspase-1.It p20-ekspresjenivo waard screened..G. duodenalis alpha-2 en alpha-7.3 giardines waarden oarspronklik identifisearre troch it mjitten fan NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 en caspase-1 p20), IL-sekretion.1β-nivo's, apoptotyske spotted protein (ASC) oligomerisaasjenivo's, en immunofluorescent lokalisaasje fan NLRP3 en ASC.De rol fan 'e NLRP3-inflammasome yn' e patogenisiteit fan G. duodenalis waard doe beoardiele mei mûzen wêryn NLRP3-aktivearring blokkearre waard (NLRP3-blokkearre mûzen) en patologyske feroaringen yn lichemsgewicht, duodenale parasitêre lading en duodenale weefsel waarden kontrolearre.Dêrnjonken ûndersochten wy oft hiardines alpha-2 en alpha-7.3 IL-1β-sekresje yn vivo ynliede fia it NLRP3-inflammasome en bepale de rol fan dizze molekulen yn 'e patogenisiteit fan G. duodenalis yn mûzen.
Alpha-2 en alpha-7.3 giardines induce de aktivearring fan de NLRP3 inflammasome in vitro.Dit late ta de aktivearring fan p20 caspase-1, in ferheging fan 'e ekspresjenivo's fan NLRP3, pro-IL-1β, en pro-caspase-1 aaiwiten, in signifikante ferheging fan IL-1β sekretion, de formaasje fan ASA-flekken yn' e cytoplasma, en de ynduksje fan ASA-oligomerisaasje.NLRP3-ûntstekking Penile ferlies fergruttet de pathogeniteit fan G. duodenalis yn mûzen.Mûzen behannele mei cysten troch sonde fan NLRP3-blokkeare mûzen eksposearre in ferhege oantal trophozoites en swiere skea oan 'e duodenale villi, karakterisearre troch nekrotyske krypten mei krimp en fertakking.Yn vivo eksperiminten hawwe sjen litten dat giardines alpha-2 en alpha-7.3 sekretaris fan IL-1β kinne inducearje fia it NLRP3-inflammasome, en ymmunisaasje mei giardines alpha-2 en alpha-7.3 fermindere de patogenisiteit fan G. duodenalis yn mûzen.
Mei-elkoar suggerearje de resultaten fan dizze stúdzje dat giardia alpha-2 en alpha-7.3 feroarsaakje opregulaasje fan host NLRP3-ûntstekking en ferminderje de ynfeksje fan G. duodenalis yn mûzen, dy't tasizzende doelen binne foar it foarkommen fan giardiasis.
Giardia duodenum is in ekstrazellulêre protozoa-parasyt dy't yn 'e lytse darm libbet en jierliks ​​280 miljoen gefallen fan giardiasis mei diarree feroarsaket, benammen ûnder jonge bern yn ûntwikkelingslannen [1].Minsken wurde besmet troch drinkwetter of iten besmet mei M. duodenum cysts, dy't dan yn 'e mage en wurde útskieden yn de maag sappen.Giardia duodenum trophozoites hechtsje oan it duodenale epithelium, wêrtroch wearze, braken, diarree, abdominale pine, en gewichtsverlies.Persoanen mei ymmúnsteurnissen en cystyske fibrosis binne gefoelich foar ynfeksje.Ynfeksje kin ek foarkomme troch orale en anale seks [2].Drugs lykas metronidazol, tinidazol, en nitazoxanide binne de foarkar behannelingopsjes foar duodenale ynfeksjes [3].Dizze gemoterapy-medisinen feroarsaakje lykwols neidielige side-effekten lykas misbrûk, karzinogenese, en genotoksisiteit [4].Dêrom moatte mear effektive strategyen ûntwikkele wurde om G. duodenalis-ynfeksje te foarkommen.
Inflammasomen binne in klasse fan cytosolyske proteïnekompleksen dy't diel útmeitsje fan 'e oanberne ymmúnreaksje, dy't helpe te ferdigenjen tsjin patogeen-ynvaazje en bemiddelje inflammatoare antwurden [5].Under dizze inflammasomen is nukleotide-binende oligomerisaasje (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotide-binende oligomerisaasje (NLRP3) nukleotide-ferbinende-like inflammasome wiidweidich ûndersocht, om't it kin wurde ûntdutsen troch ferskate pathogen / skea-assosjearre molekulêre patroanen (PAMP / DAMP), erkent, aktivearret it oanberne ymmúnsysteem.en regelet intestinale homeostasis yn in protte inflammatoare sykten [6,7,8].It bestiet út de patroanherkenningsreceptor (PRR) NLRP3, in adapter apoptotysk spotted protein (ASC), en in effektor procaspase-1 of procaspase-11.It NLRP3-inflammasom fungearret as gasthear tsjin ynvaazje fan patroanen, lykas waarnommen yn Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], en Leishmania-stúdzjes.[11], mar it is ek rapportearre dat aktivearring fan 'e NLRP3-inflammasom beskermjende ymmúnreaksjes beheint en sykteprogression fergruttet, bygelyks yn wjirms [12].Op grûn fan ús eardere befiningen rapporteare wy dat ekstrazellulêre G. duodenalis yntrazellulêre aktivearring fan NLRP3-ûntstekking trigger en modulearret host-inflammatoare antwurden troch sekretearjen fan ekstrazellulêre vesicles (EV's) [13].De rol fan it NLRP3-inflammasome yn G. duodenalis-ynfeksje yn vivo bliuwt lykwols fêst te stellen.
Giardins waarden oarspronklik beskreaun as strukturele komponinten fan it G. duodenalis cytoskelet en spylje in wichtige rol yn trophozoite motiliteit en epitheliale sel oanhing yn 'e lytse darm.Om better oan te passen oan 'e omjouwing en har patogeniciteit te fergrutsjen, ûntwikkele G. duodenalis trophozoites in unike cytoskeletale struktuer besteande út 8 flagella, 1 middelste lichem, en 1 ventral disc [14].De trophozoites fan Giardia duodenum brûke har cytoskelet om de boppeste lytse darm te penetrearjen, benammen de duodenum, en hechtsje oan enterocytes.Se migrearje konstant en hechtsje oan epitheliale sellen mei selmetabolisme.Dêrom is d'r in nauwe relaasje tusken har cytoskelet en virulinsje.Giardines spesifyk foar Giardia duodenum binne ûnderdielen fan 'e cytoskeletstruktuer [15] en wurde ferdield yn fjouwer klassen: α-, β-, γ-, en δ-giardines.D'r binne 21 leden fan 'e α-giardin-famylje, dy't allegear in kalzium-ôfhinklike fermogen hawwe om fosfolipiden te binen [16].Se ferbine ek it cytoskelet mei it selmembraan.Yn persoanen mei diarree feroarsake troch G. duodenalis, α-giardins binne tige útdrukt en immunoreactive tidens ynfeksje [17].Heterologe faksins basearre op Giardia alfa-1 beskerme tsjin giardiasis yn mûzen en binne potinsjele kandidaat-antigenen foar faksinûntwikkeling [18].Alpha-8 giardin, lokalisearre yn 'e plasmamembrane en flagella, mar net yn' e ventral disc, fersterket de motiliteit en groei fan trophozoites yn G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin hechtet oan mikrotubule-struktueren op flagella en beynfloedet de leefberens fan G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine is oanwêzich yn oerfloed yn 'e hiele libbenssyklus, en oerekspresje fan alpha-11 giardine skeat G. duodenalis sels [21].It is lykwols ûndúdlik oft alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine beskermjend binne tsjin G. duodenalis-ynfeksje en har ûnderlizzende meganismen.
Yn dizze stúdzje waarden rekombinante eukaryotyske ekspresjeplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine transfektearre yn mûs primêre peritoneale makrofagen om host NLRP3 te aktivearjen.Inflammasome doelen waarden doe screened.Wy beoardielje ek de rol fan it NLRP3-inflammasome yn 'e patogenisiteit fan G. duodenalis, ûndersocht oft alpha-2 en alpha-7,3-giardines aktivearring fan' e NLRP3-inflammasome yn vivo inducearje, en bepale dat dizze twa rollen fan giardines yn 'e pathogeniciteit fan G. duodenalis.Us mienskiplike doel wie om tasizzende doelen te ûntwikkeljen foar it foarkommen fan G. duodenalis-ynfeksje.
Wyldtype (WT) C57BL / 6 froulike mûzen fan 5-8 wiken waarden kocht fan Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Sina).Mûzen hienen frije tagong ta wetter, krigen sterilisearre iten en waarden hâlden yn in 12/12 oere ljocht / tsjuster syklus.Foardat ynfeksje krigen mûzen antibiotika ad libitum yn drinkwetter oanfolle mei ampicilline (1 mg / ml), vancomycin (1 mg / ml), en neomycin (1,4 mg / ml) (allegear kocht út Shanghai, Sina, keunstmjittige organismen) [22 ].].Mûzen dy't it fermogen ferlearen om te iten en te drinken foar > 24 oeren en ferlern ≥ 20% lichemsgewicht waarden minsklik euthanized troch cervical dislokaasje.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, FS) waarden oanfolle mei 12,5% fetale bovine serum (FBS; Every Green, Zhejiang, Sina) en 0,1% bovine bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, Feriene Steaten) ).USA) ûnder mikroaerobe omstannichheden.Confluent trophozoites waarden sammele op iis en trochjûn yn in ferhâlding fan 1: 4 foar fierdere reproduksje.
Giardia duodenum cysts waarden feroarsake lykas earder beskreaun [23], trophozoites waarden rispe yn logaritmyske faze en dan verdund mei ynkapseling inducing medium, pH 7.1 (wizige TYI-S-33) nei in definitive konsintraasje fan 1 × 106 trophozoites / ml.galkonsintraasje 0,05% medium).Trophozoites waarden kultivearre ûnder anaerobe omstannichheden by 37 ° C oant de logaritmyske groeifaze.Feroarje it medium nei cyst inducing medium (pH 7.8; modifisearre TYI-S-33 medium mei 1% galle konsintraasje) en kultuer G. duodenalis by 37 ° C foar 48-96 oeren, wêrby't de formaasje cysts waarden waarnommen ûnder in mikroskoop.Nei't de measte fan 'e trophozoites waarden feroarsake om cysten te foarmjen, waard it kultuermingsel rispe en opnij suspendearre yn sterile deionisearre wetter om de oerbleaune trophozoites te lysearjen.Cysten waarden teld en opslein by 4 ° C foar folgjende analyzes troch in magebuis yn mûzen.
Giardia ekstrazellulêre vesicles (GEV's) waarden ferrike lykas earder beskreaun [13].Trophozoites yn logaritmyske groei faze waarden resuspended yn wizige TYI-S-33 medium taret mei exosome-depleted FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) nei in definitive konsintraasje fan 1 × 106 parasiten / mL en incubated foar 12 oeren.waarden isolearre fan 'e kultuersupernatant troch centrifugaasje by 2000 g foar 10 min, 10.000 g foar 45 min, en 100.000 g foar 60 min.Precipitaten waarden oplost yn phosphate buffered saline (PBS), kwantifisearre mei in BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en opslein by -80 ° C. of brûkt direkt foar fierdere analyzes.
Primêre mûs peritoneale makrofagen waarden taret lykas earder beskreaun [24].Koartsein, mûzen (âld 6-8 wiken) waarden ynjeksje (intraperitoneaal [ip]) mei 2.5 ml fan 2.98% Difco floeiber thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) en fiede 3-4 ferwulften.In suspensie fan makrofagen waard sammele út 'e abdominale holte fan mûzen nei eutanasy en 3 kear sintrifuge by 1000 g foar 10 min.Harvested sellen waarden ûntdutsen troch flow cytometry mei help fan de CD11b marker oant sel suverens wie> 98%, dan tafoege oan 6-well sel kultuer platen (4.5 x 106 sellen / well) en ynkubearre mei 10% FBS (Bioindustry) by 37 ° C.en 5% CO2.
RNA waard ekstrahearre út 1 × 107 trophozoites yn 1 ml fan TRIzol reagens (Vazyme, Nanjing, Sina), genomysk DNA waard ekstrahearre út totaal G. duodenalis RNA mei MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Sina) en komplementêr DNA (cDNA) waard synthesized mei MonScript RTIIII Super Mix (Monad) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.
CDS-sequence-ynformaasje foar it doel G. duodenalis-gen waard krigen fan 'e NCBI GenBank.Brûk Primer 5.0 om spesifike naadleaze kloningsprimers foar elk doelgen te ûntwerpen.De foarút primer (5′-3′) bestiet út trije dielen: in oerlaapjende folchoarder mei in linearized vector pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) en start codons ATG en GNN (as de earste basis is net G).Dit wurdt dien om de effisjinsje fan 'e ekspresje te ferbetterjen.Dêrneist op syn minst 16 bp kombinearre basen (GC ynhâld 40-60% / Tm likernôch. 55 ° C).De omkearde primer (5′-3′) bestiet út twa dielen, in oerlappende folchoarder mei in EcoRV-linearisearre vector pcDNA3.1 (+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) en in kombinearre basis fan op syn minst 16 bp.(útsein de lêste twa haltes).basen) in codon lykas AA of GA om rekombinante plasmiden mooglik te meitsjen om har markearre proteïnen út te ekspresjen).De primer-sekwinsjes wurde neamd yn Tabel 1 en waarden synthesized troch Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Sina).
Doelen waarden fersterke mei Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, Sina) of Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Sina) mei help fan taret G. duodenalis cDNA as sjabloan.De eukaryotyske ekspresjevektorplasmide pcDNA3.1(+) waard linearisearre mei beheiningenzyme EcoRV en defosforylearre mei Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearisearre pcDNA3.1(+)-fragminten en fersterke doelgenfragminten waarden suvere mei in DNA-gelreinigingskit (Tiangen) en kwantifisearre mei in Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).It pcDNA3.1 (+) fragmint en elk doelgenfragmint waarden rekombinearre mei MonClone single assembly cloning mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Sina) en befêstige troch DNA-sekwinsje mei Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Sina)..
Endotoxine-frije plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 waarden generearre mei de SanPrep Endotoxin-frije Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).De konsintraasje waard bewarre boppe 500 ng / µl om te soargjen dat de EDTA yn 'e elueringsbuffer net ynterfere mei de transfeksje-assay.Primêre mûs peritoneale makrofagen waarden kultivearre yn 6-well platen mei folslein RPMI 1640 medium (Biological Industries) foar 12 oeren, dan waarden de sellen 3 kear wosken yn waarme PBS om penicilline en streptomycin te ferwiderjen, en dan yn medium oanfolle mei folslein medium.Endotoxine-frije plasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) waarden verdund yn 125 μl fan Opti-MEM redusearre serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Dêrnei waard 5 µl Lipofectamine 2000 transfeksje reagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) verdund yn 125 µl leech serum Opti-MEM medium.Bereid liposoom-DNA-kompleksen troch it fertinne endotoxinefrije plasmide te mingjen mei Lipofectamine 2000 en it mingsel 5 minuten by keamertemperatuer te stean.Ferpleatse de kompleksen apart nei sellen yn elke put en mingje stadich.Nei 4 oeren waard it selkultuermedium ferfongen troch 2 ml folslein RPMI 1640-medium en de kultuer waard 24 oeren trochset.Farsk selkultuermedium waard tafoege oan 'e sellen en ynkubeare foar ferskate tiidpunten ôfhinklik fan it assay-ûntwerp.
Proteinmonsters fan supernatanten en sellysaten waarden taret lykas earder beskreaun [25].Membraanferfierparameters foar pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, en His-tag wiene 200 mA / 90 min.Foar interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, FS), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switserlân) en NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switserlân) en 1: 5000 rjochte op syn tag (Amylet Scientific, Wuhan, Sina) en β-actin (Proteintech, Wuhan, Sina).
Cross-linking mei disuccinimide suberate (DSS) waard útfierd lykas earder beskreaun [26].Sellen waarden 3 kear wosken mei kâld PBS en folslein lysearre mei in 27 gauge needle yn 50 µl ASC-reaksjebuffer (pH 8.0) mei 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES en 125 mM NaHCO3.It mingsel waard 3 min sintrifuge op 5000 g en de pellet waard sutured mei 10 µl DSS (25 mM yn DMSO) en 40 µl ASC-reaksjebuffer foar 30 min by 37 ° C.Nei sintrifugering by 5000 g foar 10 min, waard de pellet oplost yn in oplossing fan 40 µl ASC-reaksjebuffer en 10 µl fan 6x proteïne-ladenbuffer (TransGen, Beijing, Sina), en dan waard de oplossing by keamertemperatuer foar 15 quenched. min., Dan siede 10 minuten.Proteinmonsters waarden doe ûnderwurpen oan westerske blotting mei primêre anty-ASC-antylders (Wanleibio, Shenyang, Sina) by in fertúnferhâlding fan 1:500.
Nei in earder beskreaune proseduere [13] waarden selkultuer-supernatanten sammele en sekretion fan it pro-inflammatoare cytokine IL-1β waard bepaald mei it mûs IL-1 Beta ELISA-kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvertearje OD450nm-wearden nei proteïnekonsintraasjes mei de IL-1β standertkromme.
Sellen coated op coverslips waarden sêft wosken 3 kear yn waarme PBS, fêst yn tissue cell fixative (Biosharp, Beijing, Sina) foar 10 min by keamertemperatuer (RT), yn 0,1% Triton X-Permeabilize op 100 (fertinne yn PBS; Biosharp) ) foar 20 minuten by keamertemperatuer en blokkearje yn 5% bovine serumalbumine (yn PBS) foar 2 oeren by keamertemperatuer.Sellen waarden dan oernachtich by 4 ° C ynkubeare mei primêre antylders tsjin ASC (1:100-dilution) of NLRP3 (1:100-dilution), respektivelik, en Cy3-markearre geit anty-konyn IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) of FITC-konjugearre geit anty-mûs IgG (1:400; Earthox) oernacht by 37 ° C yn it tsjuster foar 1 oere.De kearnen waarden kleurd mei Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, Sina) foar 5 minuten en waarnommen ûnder in fluoreszensmikroskoop (Olympus Corporation, Tokio, Japan).
Mûzen waarden ferdield yn fjouwer groepen (n = 7 yn elke groep): (i) PBS-behannele negative kontrôlegroep (allinich PBS; sonde 100 µl / mûs PBS folge troch deistige intraperitoneale ynjeksje 100 µl / mûs PBS 3 oeren letter).kontinu foar 7 dagen);(ii) negative kontrôtgroep behannele mei MCC950-ynhibitor [27] (100 µl / mûs fia PBS-sonde, 3 oeren letter, 10 mg / kg lichemsgewicht [BW] MCC950 [yn PBS] waard intraperitoneaal deistich administraasje, duorje 7 dagen);(iii) G. duodenalis cyst-ynfeksjegroep (1.5 x 106 cysten / mûs troch sonde, 3 oeren letter, 100 μl / mûs PBS intraperitoneaal deistich foar 7 dagen administraasje);(iv) G. duodenalis cyst kombinearre ynfeksje groep MCC950 inhibitor behanneling groep (1.5 × 106 cysts / mûs fia sonde, 10mg / kg lichemsgewicht MCC950 intraperitoneally deistich foar 7 dagen op 3h).It lichemsgewicht fan elke mûs waard deistich kontrolearre en alle mûzen waarden op 'e 7e dei euthanisearre.Harvested duodenum (3 sm lang) waard yn lytse stikken yn 1 ml PBS knipt, cysten waarden oernacht yn PBS by 4 ° C ferneatige, en G. duodenalis trophozoites.Farske duodenum (1 sm lang) waard isolearre foar hematoxylin en eosin (H&E) kleuring.
Mûzen waarden ferdield yn twa groepen: (i) MOCK-kontrôlegroep en (ii) MCC950-ynhibitorgroep.Der wiene fiif behannelingen yn elke groep (n = 7 / behanneling groep): (i) PBS behanneling negative kontrôle groep (allinich PBS; 100 µl / mûs PBS, intramuscular (IM) ynjeksje (tibialis anterior) [28, 29]; ( ii) pcDNA3.1 (+) plasmide negative kontrôle groep (100 µg / mûs DNA, fia intramuscular ynjeksje) G. duodenalis cyst ynfeksje positive kontrôle groep (1,5 x 106 cysten / mûs, fia sonde) (iv) a); groep behannele mei plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/mûs-DNA, troch intramuskulêre ynjeksje), en (v) in groep behannele mei plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mûs) DNA, nei 12 oeren fan passaazje, krigen mûzen yn 'e MCC950-ynhibitorgroep in deistige intraperitoneale ynjeksje fan MCC950 (10 mg / kg lichemsgewicht) foar 7 dagen, wylst mûzen yn' e MOCK-groep in lykweardich folume fan PBS-behanneling krigen. sammele fan 'e eyeballs-mûzen en oernachtsje by 4 ° C Serummonsters waarden isolearre mei enzyme-keppele immunosorbent-assay (ELISA) foar en mjittingen fan IL-1β-nivo's.
Fiifentritich mûzen waarden ferdield yn fiif groepen (n = 7 / groep).Groep 1 wie in negative kontrôlegroep behannele mei PBS: mûzen krigen 100 μl fan PBS intramuskulêr en 3 dagen letter troch sonde.Groep 2 is in positive kontrôtgroep ynfektearre mei G. duodenalis cysts: mûzen waarden ynjeksje mei 100 μl fan PBS, en 3 dagen letter 1.5 x 106 cysts / mûs waarden ynjeksje yntragastrysk.Tredde groep - plasmidimmunisaasje mei pcDNA3.1(+) yn kombinaasje mei in kontrôlegroep foar duodenale cystynfeksje: mûzen krigen 100 μg plasmid DNA pcDNA3.1(+)(im) oraal, 1.5×106 cysten/mûs 3 foar ferskate dagen.Groepen 4 en 5 wiene rekombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmide yn kombinaasje mei G. duodenalis cyst ynfeksje.Eksperimintele groep: mûzen krigen 100 µg pcDNA3.1 (+) -giardine plasmide DNA (im), dan 3 dagen letter, 1.5 × 106 cysten / mûs waarden ynjeksje fia sonde.It lichemsgewicht fan elke mûs waard kontrolearre nei de ynfiering fan 'e G. duodenalis cyst troch de buis.Farske duodenum waard sammele foar mjittingen fan parasitêre lading en HE-kleuringsanalyse.
Histopatologyske feroaringen waarden analysearre neffens in earder publisearre proseduere [30].Frjemde duodenum waard fêstmakke mei tissue-selfixative, ynbêde yn paraffine, snijden yn 4 μm-seksjes, kleurde mei H&E en analysearre ûnder in ljochtmikroskoop.Fertsjintwurdige patologyske feroaringen yn sân tissue-seksjes fan sân ûnôfhinklike mûzen waarden evaluearre troch in patolooch dy't net bewust wie fan 'e behanneling en waarden fêstlein by 200x fergrutting.De lingte fan 'e villi en de djipte fan' e krypten waarden mjitten yn oerienstimming mei de earder beskreaune metoaden.
De resultaten in vitro en in vivo waarden krigen yn triplicate.Grafiken waarden oanmakke mei GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, FS).Ferskillen tusken twa groepen waarden analysearre troch t-test, wylst ferskillen tusken ≥3 groepen waarden analysearre troch ien-wize analyze fan fariânsje (ANOVA) mei SPSS software (ferzje 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, Feriene Steaten).Gegevens waarden analysearre foar homogeniteit fan fariânsje mei Levene's test folge troch Bonferroni's post hoc test (B).De betsjutting wurdt útdrukt as P<0.05, P<0.01, en P<0.001 (net signifikant [ns]) (P>0.05).
Us eardere analyze fan GEV-proteomics yn 'e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) liet sjen dat in protte doelen belutsen kinne wurde by de aktivearring fan inflammatoare sinjaalpaden [13].Wy selekteare twa kânsrike doelen, alpha-2 en alpha-7.3 giardins, fersterkje dizze molekulen en brûke se om de pcDNA3.1 (+) eukaryotyske ekspresjevektor te konstruearjen.Nei sequencing, rekombinante pcDNA3.1 (+) -alpha-2 en alpha-7.3 giardine ekspresje plasmiden waarden transfected yn primêre mûs peritoneal makrofagen, en de caspase-1 p20 hântekening protein fan ûntstekking (in fragmint fan aktivearre caspase-1) waard identifisearre as it ophelderjen fan kaaimolekulen dy't ûntstekking kinne triggerje.De resultaten lieten sjen dat alpha-2 en alpha-7.3 giardines kinne p20 caspase-1 ekspresje fergelykje mei GEV.Gjin effekt op caspase-1-aktivearring waard fûn yn 'e net behannele negative kontrôle (allinich PBS) en plasmidkontrôle pcDNA3.1 (+) (figuer 1).
Meting fan p20 caspase-1 aktivearring troch pcDNA3.1 (+) -alpha-2 en alpha-7.3 giardins.Rekombinante eukaryotyske ekspresjeplasmiden pcDNA3.1 (+) -alpha-2 en alpha-7.3 giardines (boppe elke baan) waarden transfekteare yn primêre mûs peritoneale makrofagen en kultuersupernatanten waarden 24 oeren letter rispe.Western blotting waard brûkt om ekspresjenivo's te mjitten fan it hantekening caspase-1 p20 inflammasome protein.De PBS-allinich behannelinggroep (laan C) en de pcDNA3.1 (+) monotherapy-groep (pcDNA3.1 lane) waarden brûkt as in negative kontrôle, en de GEV-behanneling groep waard brûkt as in positive kontrôle.Ekspresje fan it rekombinante proteïne waard befêstige troch it opspoaren fan in histidine-tag yn elk proteïne, en de ferwachte proteïnebands wiene alpha-2 giardine (38.2 kDa) en alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearisearre vector, SUP, supernatant
Om te bepalen oft alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine p20-caspase-1-ekspresje induce en in rol spylje by it aktivearjen fan de host NLRP3-inflammatoare reaksje, pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardine en pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin waard transfektearre yn primêre mûs peritoneale makrofagen mei rekombinant plasmid DNA, en nivo's fan ekspresje, lokalisaasje en oligomerisaasje fan 'e kaai inflammatoare aaiwiten NLRP3 waarden bepaald.Yn dit eksperimint waard GEV brûkt as de positive kontrôle groep, en de gjin behanneling groep (allinich PBS) of de pcDNA3.1 (+) transfeksje behanneling groep wie de negative groep.De resultaten lieten sjen dat, lykas yn 'e GEV-groep, rekombinant plasmid DNA fan giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 en giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 resultearre yn opregulaasje fan NLRP3, pro-IL-1β en procaspase-1 en caspase-1 aktivearring (fig. 2a).Dêrnjonken feroarsake beide giardines signifikante IL-1β-sekresje (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (figuer 2b).De measte ASC-proteinen wiene monomerysk yn 'e groep sûnder behanneling of yn' e behannelinggroep transfektearre mei it pcDNA3.1(+)-plasmide, yn tsjinstelling ta pcDNA3.1(+)-alpha-2 of pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 gyld.ASC-oligomerisaasje barde yn 'e rekombinante plasmide-DNA fan' e GEV-positive kontrôtgroep as groep, dy't in oligomere foarm toant (figuer 2c).Dizze foarriedige gegevens suggerearje dat alpha-2-giardine en alpha-7,3-giardine de aktivearring fan NLRP3-ûntstekking kinne inducearje.Opfolgjende immunofluorescent stúdzjes fan 'e lokalisaasje fan ASC en NLRP3 lieten sjen dat yn' e negative kontrôtgroep it ASC-proteïne ferspraat waard oer it cytoplasma en ferskynde as in puntsignal by stimulearring fan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 mei giardine of pcDNA3.1 (+) -alpha-7,3 giardine groep of GEV positive kontrôle groep (figuer 2d).Yn 'e negative kontrôle en plasmid-behannele pcDNA 3.1-groepen waard it NLRP3-proteinsinjaal net ûntdutsen, wylst in fluorescent sinjaaldot yn antwurd op pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 waard ûntdutsen..giardine wurde fûn yn it cytoplasma of by stimulearring fan de HEV (Fig. 2e).Dizze gegevens litte fierder sjen dat G. duodenalis giardin alpha-2 en giardin alpha-7.3 it NLRP3-inflammasome aktivearje yn mûs primêre peritoneale makrofagen.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin aktivearje de NLRP3-inflammasome yn mûs peritoneale makrofagen.Transfektearje de rekombinante eukaryotyske ekspresjeplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin en pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin yn primêre murine peritoneale makrofagen en sellen, of rispje de supernatant binnen 24 h foar analyse fan ekspresje, oligomerisaasje , útskieding.en lokalisaasje fan wichtige inflammatoare aaiwiten.De PBS-allinich (C) groep en de pcDNA3.1 (+) single behanneling groep waarden brûkt as de negative kontrôle, en de GEV behanneling groep waard brûkt as de positive groep.a Key inflammatoire aaiwiten NLRP3, ynklusyf NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, en p20 caspase-1, waarden ûntdutsen troch Western blotting.b De nivo's fan sekretion fan IL-1β yn 'e supernatanten waarden bepaald mei enzyme-keppele immunosorbent-assay (ELISA).Ferskillen tusken kontrôle en eksperimintele groepen waarden analysearre troch ien-manier analyze fan fariânsje (ANOVA) mei SPSS software ferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan tusken groepen **P<0.01 en ***P<0.001.c ASC-oligomerisaasjenivo's yn pellets waarden bepaald troch DSS-cross-linking-analyse, wylst ASC-nivo's yn sellysaten waarden brûkt as ladenkontrôle.d Fisualisaasje fan ISC lokalisaasje mei help fan immunofluorescence.e Immunofluorescence waard brûkt om de lokalisaasje fan NLRP3 te visualisearjen.ASC, apoptotyske spek-like proteïne;IL, interleukin;NLRP3, nukleotide-binende oligomerisaasje-like receptor 3;ns, net signifikant (P > 0.05)
Sawol G. duodenalis as de GEV's dy't it sekretearret aktivearje it NLRP3-inflammasom en regelje gasthear-inflammatoare antwurden yn vitro.Sa bliuwt de rol fan it NLRP3-inflammasome yn 'e pathogeniteit fan G. duodenalis ûndúdlik.Om dit probleem te ûndersykjen, hawwe wy in eksperimint ûntworpen tusken mûzen ynfekteare mei G. duodenalis cyst en mûzen ynfekteare mei G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor behanneling en fergelike NLRP3 inflammasome ekspresje doe't ynfekteare mei G. duodenalis cyst.In detaillearre skema fan it eksperimint wurdt werjûn yn figuer 3a.Feroaringen yn lichemsgewicht fan mûzen yn ferskate behannelingsgroepen waarden kontrolearre foar 7 dagen nei ynfeksje mei cysten, en de resultaten wurde werjûn yn Fig. 3b.Yn ferliking mei de groep dy't behannele waard mei suvere PBS, lieten de resultaten sjen dat (i) it lichemgewicht fan mûzen dy't mei G. duodenalis cyst ynfekteare fermindere fan dei 3 oant dei 7 nei ynfeksje;(ii) behanneling mei de MCC950-ynhibitor hie gjin signifikant effekt op it lichemsgewicht fan 'e mûzen..Yn ferliking mei de ienige ynfeksjegroep fermindere de BW fan 'e duodenale ynfeksjegroep behannele mei MCC950 yn ferskate graden (Dei 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Dei 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Dag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dei 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175;Dizze gegevens litte sjen dat it NLRP3-inflammasome mûzen beskermet tsjin signifikant gewichtsverlies yn 'e iere stadia (2-4 dagen) fan duodenale ynfeksje.Wy wiene doe fan doel om G. duodenalis trophozoites te ûntdekken yn duodenale lavage fluid en de resultaten wurde werjûn yn figuer 3c.Yn ferliking mei de G. duodenalis cyst-ynfeksjegroep is it oantal trophozoites yn 'e duodenum signifikant ferhege nei it blokkearjen fan it NLRP3-inflammasom (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Duodenale weefsels kleurde mei HE toande, yn ferliking mei negative kontrôle behannele mei PBS en MCC950 allinich: (i) G. duodenalis cyst-ynfeksje resultearre yn skea oan 'e duodenale villi (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488 ) en kryptatrophy (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum fan mûzen ynfektearre mei G. duodenalis cysten en behannele mei MCC950-ynhibitoren.duodenale villi waarden skansearre en dea (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) mei atrophy en kryptfertakking (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Dizze resultaten suggerearje dat it NLRP3-inflammasome in rol spilet by it ferminderjen fan de patogenisiteit fan G. duodenalis.
Rol fan NLRP3-inflammasome yn Giardia duodenum-ynfeksje.Mûzen waarden gavaged (iv) mei duodenokokkale cysten en dêrnei behannele mei of sûnder MCC950 (ip).Single behanneling groepen mei PBS of MCC950 waarden brûkt as kontrôles.Eksperimintele groep en behanneling regimen.b It lichemsgewicht fan mûzen yn elk fan 'e ferskate behannelinggroepen waard 7 dagen kontrolearre.It ferskil tusken de G. duodenalis-ynfeksjegroep en de G. duodenalis + MCC950-ynfeksjebehannelingsgroep waard analysearre troch t-test mei SPSS-softwareferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan by *P<0.05, **P<0.01, of ***P<0.001.c Parasitêre lading waard bepaald troch it tellen fan it oantal trophozoites yn duodenale lavage fluid.It ferskil tusken de G. duodenalis-ynfeksjegroep en de G. duodenalis + MCC950-ynfeksjebehannelingsgroep waard analysearre troch t-test mei SPSS-softwareferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan by *P <0.05.d Hematoxylin en eosin (H&E) kleuringsresultaten fan duodenale histopatology.Reade pylken jouwe skea oan 'e villi, griene pylken jouwe skea oan' e krypten.Skaalbalke: 100 µm.e, f Statistyske analyze fan duodenal villus hichte en mûs krypt hichte.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan by *P<0.05 en **P<0.01.De resultaten binne nommen út 7 ûnôfhinklike biologyske eksperiminten.BW, lichemsgewicht;ig, intragastryske leveringsrûte;ip, intraperitoneale levering rûte;ns, net signifikant (P> 0,05);PBS, fosfaatbufferde saline;WT, wyld type
De útskieding fan IL-1β is in skaaimerk fan ûntstekkingsaktivearring.Om te bepalen oft G. duodenalis alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine de NLRP3-host-inflammasome yn vivo aktivearje, brûkten wy unbehannele WT-mûzen (sham-groep) en NLRP3-inflammasome-blokkeare mûzen (MCC950-ynhibearre behannelinggroep).In detaillearre skema fan it eksperimint wurdt werjûn yn figuer 4a.Eksperimintele groepen bestie út mûzen behannele mei PBS, G. duodenalis cyst behanneling troch sonde, intramuscular ynjeksje fan pcDNA3.1, en intramuscular ynjeksje fan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine of pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Op 'e 7e dei nei intramuskulêre administraasje fan it rekombinante plasmid waard serum sammele en it nivo fan IL-1β yn elke groep waard bepaald.Lykas werjûn yn figuer 4b, yn 'e MOCK-groep: (i) yn ferliking mei de PBS-groep, hie pcDNA3.1-behanneling gjin signifikant effekt op IL-1β-sekretion (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), lykwols, IL-β-sekretion waard signifikant ferhege yn 'e G. duodenalis-cystgroep (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine en pcDNA3.1- Intramuskulêre ynjeksje fan alpha-7.3 giardine signifikant ferhege serum IL-1β-nivo's (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3-giardine feroarsake hege nivo's fan IL-1β-sekretion yn 'e pcDNA3.1-alpha-2-giardine intramuskulêre ynjeksjegroep (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Yn ferliking mei elke groep yn 'e MCC950-behannelingsgroep en de MOCK-groep: (i) IL-1β-sekretionsnivo's yn' e PBS-kontrôlegroep en de pcDNA3.1-kontrôlegroep fermindere ta in beskate mjitte nei it blokkearjen fan de MCC950-ynhibitor, mar it ferskil wie net signifikant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) nei't blokkearje MCC950., IL-1β-sekretion waard signifikant fermindere yn 'e G. duodenalis-cyst-ynfekteare groep, de pcDNA3.1-alpha-2-giardine-groep, en de pcDNA3.1-alpha-7.3-giardine-groep (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA 5, F(9; ) = 3,540, P = 0,0164).Dizze resultaten suggerearje dat alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine de aktivearring fan it NLRP3-inflammasome yn vivo bemiddelje.
pcDNA3.1(+)-giardines aktivearje de NLRP3-host-inflammasome yn vivo.Mûzen waarden ymmunisearre (IM) mei rekombinant eukaryotyske ekspresjeplasmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine en dêrnei behannele mei MCC950 (ip; MCC950-groep) of net (dummy-groep) ).De PBS of pcDNA3.1 (+) plasmid behanneling groep waard brûkt as in negative kontrôle, de G. duodenalis cyst behanneling groep waard brûkt as in positive kontrôle.Eksperimintele groep en behanneling regimen.b Serumnivo's fan IL-1β yn mûzen waarden op dei 7 mjitten troch ELISA-assay.Ferskillen tusken groepen yn 'e MOCK-groep waarden analysearre mei ien-wei ANOVA, en ferskillen tusken de MOCK-groep en de MCC950-groep waarden analysearre mei de t-test fan SPSS-softwareferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen tusken behannelingsgroepen yn 'e MOCK-groep, *P<0.05 en ***P<0.001;dollartekens ($) jouwe signifikante ferskillen oan tusken elke groep yn 'e MOCK-groep en de MCC950-groep by P<0.05.Resultaten fan sân ûnôfhinklike biologyske eksperiminten.i, intramuskulêre ynjeksje, ns, net signifikant (P> 0.05)
Om it effekt te ûndersiikjen fan alpha-2 en alpha-7.3-giardine-bemiddele aktivearring fan 'e NLRP3-host-inflammasome op G. duodenalis-ynfeksje, brûkten wy WT C57BL / 6-mûzen en ynjeksje alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine.it plasmide waard intramusculair ynjeksje, nei 3 dagen troch de maagbuis fan de G. duodenalis cyste, wêrnei't de mûzen 7 dagen waarnommen waarden.In detaillearre skema fan it eksperimint wurdt werjûn yn figuer 5a.It lichemsgewicht fan elke mûs waard elke dei mjitten, samples fan frisse duodenale weefsel waarden sammele op 'e 7e dei nei administraasje troch in magebuis, it oantal trophozoites waard mjitten, en histopatologyske feroaringen waarden waarnommen.Lykas werjûn yn figuer 5b, mei tanimmende fiedingstiid, ferhege de BW fan mûzen yn elke groep stadichoan.De MT fan mûzen begon te ferminderjen op 'e 3e dei nei intragastryske administraasje fan G. duodenalis cysten, en dan stadichoan tanommen.Aktivearring fan it NLRP3-inflammasom feroarsake troch intramuskulêre ynjeksje fan alpha-2-giardine en alpha7.3-giardine fermindere gewichtsverlies yn mûzen signifikant (Dei 1: pcDNA3.1-alpha-2-giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Dei 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dei 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Dei 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Dei 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Dei 4: pcDNA3.1-alpha-2 giard , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, dei 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, dei 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Dei 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Dei 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dei 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dei 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Dei 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).De parasitêre lading waard beoardiele yn 'e duodenum (fig. 5c).Yn ferliking mei de net behannele positive kontrôle en de groep ynjeksje mei de lege pcDNA3.1-fektor, waard it oantal G. duodenalis trophozoites signifikant fermindere yn 'e groepen dy't mei α-2 giardine en α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha ynjeksje) -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Dêrnjonken wie giardine alfa-7.3 mear beskermjend yn mûzen dan giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).De resultaten fan HE-kleuring wurde werjûn yn fig.5 d-f.Mûzen ynjeksje mei alpha-2 giardine en alpha-7.3 giardine hiene minder duodenal weefsel bywenne, manifestearre troch villus skea, ferlike mei mûzen ynjeksje mei G. duodenalis en mûzen ynjeksje mei G. duodenalis yn kombinaasje mei in lege pcDNA3 vector .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 of P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 of P = 0.0055) en fermindere kryptatrophy (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 of P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 of P = 0,0191).Dizze resultaten suggerearje dat alpha-2-giardine en alpha-7,3-giardine de ynfeksje fan G. duodenalis ferminderje troch it aktivearjen fan it NLRP3-inflammasom yn vivo.
Rol fan pcDNA3.1(+)-giardins yn G. duodenalis-ynfeksje.Mûzen waarden ymmunisearre (IM) mei rekombinante eukaryotyske ekspresjeplasmiden pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine of pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine en dêrnei útdage mei G. duodenalis-cysten (ig).De PBS-groep en de pcDNA3.1 (+) + duodenale cyst-behannelingsgroep waarden brûkt as negative kontrôlegroepen, en de duodenale cyst-behannelingsgroep waard brûkt as positive kontrôtgroep.Eksperimintele groep en behanneling regimen.b De MT fan mûzen yn elk fan 'e ferskate behannelinggroepen waard kontrolearre foar 7 dagen nei útdaging.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan tusken groepen yn 'e G. duodenalis-groep en de pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardine-groep, *P <0.05, **P <0.01, en ***P <0.001;it dollarteken ($) jout in signifikant ferskil oan tusken elke groep fan G. duodenalis en de pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-jardine-groep, $$P<0.01 en $$$P<0.001.c Parasitêre lading waard bepaald troch it tellen fan it oantal trophozoites yn 1 ml duodenale lavage út 'e duodenum (3 sm lang) en útdrukt as it oantal parasiten per cm duodenum.Ferskillen tusken de G. duodenalis-ynfeksjegroep, de pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardine-groep, en de pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-giardine-groep waarden analysearre troch ienwize ANOVA mei SPSS-softwareferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan by **P<0.01 en ***P<0.001.d Histopatologyske feroaringen yn 'e duodenum.Reade pylken jouwe skea oan 'e villi, griene pylken jouwe skea oan' e krypten.Skaalbalke: 100 µm.e, f Statistyske analyze fan mûs duodenal villus hichte (e) en krypt hichte (f).Ferskillen tusken groepen yn figuer 1d waarden analysearre troch ien-wei ANOVA mei SPSS-softwareferzje 22.0.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan by *P<0.05 en **P<0.01.Resultaten fan sân ûnôfhinklike biologyske eksperiminten.ns, net signifikant (P > 0.05)
Giardia duodenum is in bekende darmparasyt fan minsken en oare sûchdieren dy't giardiasis feroarsaakje.Yn 2004 waard it opnommen yn it WHO Neglected Diseases Initiative fanwege har hege prevalens oer 6 jier, benammen yn mienskippen fan lege sosjaal-ekonomyske status [32].It oanberne ymmúnsysteem spilet in krityske rol yn 'e ymmúnreaksje op G. duodenalis-ynfeksje.Mûsmakrofagen binne rapportearre om G. duodenalis te feroverjen en te deadzjen troch it frijlitten fan ekstrazellulêre trapen [33].Us eardere stúdzjes hawwe sjen litten dat G. duodenalis, in net-invasive ekstrazellulêre parasyt, aktivearret p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, en NLRP3 inflammatoare sinjaalpaden yn mûsmakrophagen om host-inflammatoare antwurden te regeljen, en frijlitten GEV kin dit proses ferbetterje.13], 24].De krekte PAMPs belutsen by NLRP3-inflammasome-regulearre ûntstekking yn GEV en de rol fan NLRP3-inflammasome yn giardiasis bliuwe lykwols te ferklearjen.Om ljocht te jaan op dizze twa fragen, hawwe wy dit ûndersyk útfierd.
It NLRP3-inflammasome leit yn it cytoplasma fan ymmúnsellen en kin wurde aktivearre troch ferskate dieltsjes lykas urinesûrkristallen, gifstoffen, baktearjes, firussen en parasiten.Yn baktearjende stúdzjes binne gifstoffen identifisearre as wichtige PAMP's dy't inflammatoare sensoren aktivearje, dy't liede ta ûntstekking en selsdea [34].Guon struktureel ferskate toxinen, lykas hemolysin fan Staphylococcus aureus [35] en Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) fan enterotoxine (NHE) [37], induce de aktivearring fan NLRP3-ûntstekking.Virale stúdzjes hawwe oantoand dat virulinsjeproteinen lykas SARS-COV-2-envelope (E)-protein [38] en Zika-virus NS5-protein [39] wichtige PAMP's binne erkend troch de NLRP3-receptor.Yn parasitenstúdzjes binne in protte parasiten rapporteare om te assosjeare mei host-inflammasome-aktivearring, lykas Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], en Leishmania [42].De dichte granuleproteinen GRA35, GRA42, en GRA43, ferbûn mei de virulinsje fan Toxoplasma gondii, binne ferplicht foar de yndeksje fan pyroptose yn Lewis-ratmakrophagen [43].Dêrnjonken hawwe guon Leishmania-stúdzjes rjochte op yndividuele molekulen dy't belutsen binne by it NLRP3-inflammasome, lykas parasytmembraan lipofosfoglycan [44] of sinkmetalloprotease [45].Under de annexin-like alpha-giardin-famylje fan genen, is alpha-1-giardin oantoand in potinsjele faksinekandidaat te wêzen dy't beskerming biedt tsjin G. duodenalis yn in mûsmodel [18].Yn ús stúdzje selekteare wy G. duodenalis virulinsjefaktoaren alpha-2 en alpha-7,3 giardines, dy't unyk binne foar giardia, mar relatyf minder rapporteare.Dizze twa doelgenen waarden klone yn 'e pcDNA3.1 (+) eukaryotyske ekspresjesysteemvektor foar analyze fan ûntstekkingsaktivaasje.
Yn ús mûsmodel tsjinje spjalte caspase-fragminten as markers fan inflammatoire aktivearring.By stimulearring ynteraktearret NLRP3 mei ASC, rekrutearret procaspases, en generearret aktive caspases dy't pro-IL-1β en pro-IL-18 spjalte yn ripe IL-1β en IL-18, respektivelik -18.Inflammatoire caspases (caspases-1, -4, -5 en -11) binne in bewarre famylje fan cysteine ​​proteases dy't kritysk binne foar oanberne ferdigening en binne belutsen by ûntstekking en programmearre selde dea [46].Caspase-1 wurdt aktivearre troch kanonike inflammasomen [47], wylst caspases-4, -5, en -11 wurde knipt by de formaasje fan atypyske inflammasomen [48].Yn dizze stúdzje brûkten wy peritoneale makrofagen fan mûzen as model en ûndersochten p20 caspase-1 spjalte caspase-1 as marker fan host NLRP3-ûntstekkingsaktivearring yn stúdzjes fan G. duodenalis-ynfeksje.De resultaten lieten sjen dat in protte alpha-giardins ferantwurdlik binne foar de typyske aktivearring fan ûntstekking, wat oerienkomt mei de ûntdekking fan wichtige virulinsjemolekulen belutsen by baktearjes en firussen.Us stúdzje is lykwols allinich in foarriedich skerm en d'r binne oare molekulen dy't net-klassike inflammasomen aktivearje kinne, lykas ús foarige stúdzje fûn sawol klassike as net-klassike inflammasomen yn G. duodenalis-ynfeksje [13].Om fierder te bepalen oft de generearre p20 caspase-1 assosjearre is mei it NLRP3-inflammasome, transfekteare wy alpha-2 en alpha-7.3 giardins yn mûs peritoneale makrofagen om wichtige molekuleproteinekspresjenivo's en ASC-oligomerisaasjenivo's te bepalen, befêstigjend dat beide α-giardins aktivearje inflammasom NLRP3.Us resultaten binne wat oars as dy fan Manko-Prykhoda et al., dy't rapporteare dat stimulearring fan Caco-2-sellen mei G. muris of E. coli EPEC-stammen allinich de fluorescinsje-yntensiteit fan NLRP3, ASC, en caspase-1 kinne ferheegje, hoewol net signifikant, wylst hoe costimulation fan G. muris en E. coli ferhege de nivo's fan trije aaiwiten [49].Dizze diskrepânsje kin wêze fanwege ferskillen yn 'e seleksje fan Giardia-soarten, sellenlinen en primêre sellen.Wy hawwe ek in vivo-assays útfierd mei MCC950 yn 5-wiken-âlde froulike WT C57BL / 6-mûzen, dy't gefoeliger binne foar G. duodenalis.MCC950 is in krêftige en selektive NLRP3-ynhibitor foar lyts molekule dy't kanonike en net-kanonike NLRP3-aktivearring blokkearret by nanomolêre konsintraasjes.MCC950 inhibits NLRP3-aktivearring, mar hat gjin ynfloed op de aktivearring fan AIM2, NLRC4, en NLRP1 inflammatoare paden of TLR-sinjalearingspaden [27].MCC950 blokkearret NLRP3-aktivearring, mar ynhibearret gjin NLRP3-inisjaasje, K + efflux, Ca2 + ynstream, of de ynteraksje tusken NLRP3 en ASC;ynstee, it inhibits NLRP3 inflammasome aktivearring troch blokkearjende ASC oligomerization [27].Dêrom brûkten wy MCC950 yn in in vivo-stúdzje om de rol fan it NLRP3-inflammasome te bepalen nei giardine-ynjeksje.Aktivearre caspase-1 p10 spjaltet pro-inflammatoire cytokines pro-IL-1β en pro-IL-18 yn folwoeksen IL-1β en IL-18 [50].Yn dizze stúdzje waarden serum IL-1β-nivo's yn giardine-behannele mûzen mei of sûnder MCC950 brûkt as in yndikator fan oft it NLRP3-inflammasome aktivearre wie.Lykas ferwachte, fermindere MCC950-behanneling signifikant serum IL-1β-nivo's.Dizze gegevens litte dúdlik sjen dat G. duodenalis giardin alfa-2 en giardin alfa-7.3 yn steat binne om it NLRP3-mûs-inflammasom te aktivearjen.
Wichtige gegevens sammele yn 'e ôfrûne desennia hawwe oantoand dat IL-17A de masterregulator is fan ymmuniteit tsjin G. muris, dy't IL-17RA-sinjalearring stimulearret, antimikrobiële peptiden produsearje en komplementaktivaasje regulearje [51].Giardia-ynfeksje komt lykwols faker foar by jonge folwoeksenen, en it is rapportearre dat Giardia-ynfeksje yn jonge mûzen de IL-17A-antwurd net aktivearret om har beskermjende effekt út te oefenjen [52], wêrtroch ûndersikers sykje nei oare immunomodulatory Giardia.meganismen fan helminth ynfeksje.De auteurs fan in resinte stúdzje rapporteare dat G. muris it NLRP3-inflammasome aktivearje kin troch E. coli EPEC, dy't de produksje fan antimikrobiële peptiden befoarderet en syn oanhingkapasiteit en it oantal trophozoites yn 'e darmkanaal ferminderet, wêrtroch't de earnst fan' e kolon ferminderet. sykten feroarsake troch bacilli [49].De NLRP3-inflammasom is belutsen by de ûntwikkeling fan ferskate sykten.Stúdzjes hawwe oantoand dat Pseudomonas aeruginosa autofagy yn makrofagen triggert om selde dea te foarkommen, en dit proses hinget ôf fan 'e aktivearring fan it NLRP3-inflammasome [53].Foar N. caninum beheint reaktive soerstofsoarten-bemiddele aktivearring fan 'e NLRP3-inflammasome har replikaasje yn' e host, wêrtroch it in potinsjele therapeutyske doel is [9].Paracoccidioides brasiliensis is fûn om de aktivearring fan 'e NLRP3-inflammasome yn mûze-knochenmark-ôflaat dendrityske sellen te stimulearjen, wat resulteart yn' e frijlitting fan 'e inflammatoare cytokine IL-1β, dy't in krityske rol spilet yn host-definsje [10].Ferskate Leishmania-soarten, wêrûnder L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, en L. infantum chagasi, aktivearje NLRP3 en ASC-ôfhinklike caspase-1 yn makrofagen, lykas Leishmania-ynfeksje.Parasyt-replikaasje wurdt fersterke yn mûzen dy't tekoart binne yn it NLRP3/ASC/caspase-1-gen [11].Zamboni et al.Leishmania-ynfeksje is rapportearre om aktivearring fan it NLRP3-inflammasome yn makrofagen te stimulearjen, wat intrazellulêre parasytreplikaasje beheint.Sa kin Leishmania NLRP3-aktivearring remme as in mijingsstrategy.Yn in vivo-stúdzjes hat it NLRP3-inflammasome bydroegen oan it eliminearjen fan Leishmania, mar hat gjin ynfloed op weefsels [54].Oarsom, yn helminthiasis-stúdzjes ûnderdrukte aktivearring fan it NLRP3-inflammasom de beskermjende immuniteit fan 'e host tsjin gastrointestinale helminthiasis [12].Shigella is ien fan 'e wichtichste baktearjes dy't diarree feroarsaakje wrâldwiid.Dizze baktearjes kinne IL-1β-produksje stimulearje fia P2X7-receptor-bemiddele K + efflux, reaktive soerstofsoarten, lysosomale fersuring, en mitochondriale skea.It NLRP3-inflammasom regelet negatyf fagocytose en bakterizide aktiviteit fan makrofagen tsjin Shigella [55].Plasmodium-stúdzjes hawwe oantoand dat AIM2, NLRP3 of caspase-1-deficiente mûzen ynfekteare mei Plasmodium hege nivo's fan type 1-interferon produsearje en mear resistint binne foar Plasmodium-ynfeksje [56].De rol fan alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine by it inducearjen fan pathogene aktivearring fan NLRP3-ûntstekking yn mûzen is lykwols ûndúdlik.
Yn dizze stúdzje fermindere ynhibysje fan 'e NLRP3-inflammasome troch MCC950 BW en fergrutte it oantal trophozoites yn intestinale lavagefloeistof yn mûzen, wat resulteart yn slimmer patologyske feroaringen yn duodenale weefsel.Alpha-2-giardine en alpha-7.3-giardine aktivearje de gastmûs NLRP3-inflammasome, ferheegje mûs lichemsgewicht, ferminderje it oantal trophozoites yn intestinale lavagefloeistof, en ferleegje patologyske duodenale lesions.Dizze resultaten suggerearje dat G. duodenalis de NLRP3-host-inflammasome aktivearje kin fia alpha-2-giardine en alpha-7,3-giardine, wêrtroch't de patogenisiteit fan G. duodenalis yn mûzen ferminderet.
Mei-elkoar litte ús resultaten sjen dat alpha-2 en alpha-7.3 giardines de aktivearring fan 'e NLRP3-host-inflammasome inducearje en de ynfeksje fan G. duodenalis yn mûzen ferminderje.Dêrom binne dizze molekulen belofte doelen foar it foarkommen fan giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: in oersjoch.It waard koartlyn iepenbiere dat Pat Inflamm allergysk is foar drugs.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: in resinsje fan pharmacotherapy.Expert miening fan in apteker.2007;8: 1885-902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, drugsresistinsje en de ûntdekking fan nije doelen.Infects Disord drug doelen.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ensfh NLRP3 inflammasome en inflammatoire sykten.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. De rol fan it inflammasom yn darmûntstekking en kanker.Gastroenterology.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonike en atypyske NLRP3-inflammasomaktivaasje op it krúspunt fan ymmúntolerânsje en darmûntstekking.pre-immune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-mediated NLRP3-inflammasome-aktivearring is belutsen by reaksje op N. caninum-ynfeksje.Parasyt vector.2020;13:449.